東方螻蛄醇提物對3種人類肝癌細(xì)胞株的細(xì)胞毒性研究

楊勇琴 張成桂 自加吉 丁小倩 楊澤芳 余 敏 熊 偉,*

1. 大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000；2. 云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南 大理 671000；3. 云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 671000

東方螻蛄醇提物對3種人類肝癌細(xì)胞株的細(xì)胞毒性研究

楊勇琴1張成桂2自加吉1丁小倩1楊澤芳1余 敏3熊 偉1,2*

1. 大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000；2. 云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南 大理 671000；3. 云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 671000

目的：通過東方螻蛄醇提物對3種人類肝癌細(xì)胞株(HepG2、BEL7402、SMMC7721)的細(xì)胞毒性測試，探討東方螻蛄醇提物的體外抗腫瘤活性。方法：采用乙醇冷浸法對東方螻蛄干燥品粉碎物進(jìn)行提取，通過聚酰胺柱層析分離劃段得到東方螻蛄醇提物的不同部位，所得部位通過MTT法對3種人類肝癌細(xì)胞株進(jìn)行體外腫瘤細(xì)胞毒性測試。結(jié)果：東方螻蛄醇提物中有2個分離組分對人類肝癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)值小于10.0 μg/mL，對人類肝癌細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性。結(jié)論：東方螻蛄醇提物中存在著對腫瘤細(xì)胞體外生長具有抑制作用的物質(zhì)，值得進(jìn)一步研究。

東方螻蛄；醇提物；肝癌細(xì)胞；MTT；細(xì)胞毒性

東方螻蛄(Gryllotalpa orientallis Burmeister)為昆蟲綱、直翅目、蟋蟀總科、螻蛄科的昆蟲，俗稱為拉拉蛄、土狗子、地拉蛄、天螻[1]。我國螻蛄資源豐富，已知品種約有50種，如東方螻蛄、華北螻蛄、歐洲螻蛄和臺灣螻蛄等[2]。其中，東方螻蛄是我國的廣布種，也是螻蛄藥材的主要商品品種，它的化學(xué)成分主要有氨基酸、微量元素、脂肪酸、甾醇和苯乙酸等[3]。以螻蛄入藥的組方始載于《呂氏春秋》，在歷代重要本草典籍中均有收集，各地民間也有廣泛的應(yīng)用。不同種類的螻蛄間類聚關(guān)系較遠(yuǎn)，對不同地域同一種的螻蛄類聚關(guān)系則較近，根據(jù)類聚關(guān)系可以采用近紅外光譜分析法對螻蛄種的分類以及螻蛄藥材進(jìn)行分析和鑒定[4]。螻蛄及其偽品的水溶液采用高效液相色譜法分析，HPLC圖譜顯示出不同的指紋特征，可對中藥螻蛄進(jìn)行品種鑒別[5]。盡管在傳統(tǒng)意義上螻蛄屬于害蟲，但隨著我國對祖國傳統(tǒng)中醫(yī)藥資源研究開發(fā)的重視，已經(jīng)陸續(xù)有關(guān)于螻蛄藥理作用的研究報道[6]。

目前，從中藥材中尋找抗腫瘤藥物及抗腫瘤藥物前體已經(jīng)成為醫(yī)藥領(lǐng)域廣大科研工作者從事的科研方向之一。據(jù)此，研究結(jié)合已有的文獻(xiàn)報道及民間使用情況，對東方螻蛄醇提物的抗腫瘤活性進(jìn)行研究。本研究主要通過乙醇對東方螻蛄干燥品粉碎物進(jìn)行提取，將醇提物通過聚酰胺柱層析分離劃段，得到不同的分離部位樣品。進(jìn)一步采用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)對3株人類肝癌細(xì)胞株(HepG2、BEL7402、SMMC7721)的細(xì)胞毒性進(jìn)行測試，以二甲基亞砜(DMSO)為空白對照，順鉑(DDP)為陽性藥物對照，通過活性測試結(jié)果比較分析，初步探討東方螻蛄醇提物的體外抗腫瘤活性。

1 材料與儀器

1.1 藥材 東方螻蛄購自安徽省亳州市藥材市場，由大理大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室張德全副教授鑒定為GryllotalpaorientallisBurmeister。如圖1所示。

1.2 細(xì)胞株 人類肝癌細(xì)胞株(HepG2、BEL7402、SMMC7721)均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.3 試劑 高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)；胎牛血清、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Gemini公司；順鉑(DDP，山東齊魯制藥廠)；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、胰蛋白酶、EDTA 、DPBS購自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司。乙醇、甲醇、異丁醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 儀器 AL204型電子天平(美國梅特勒-托利多儀器有限公司)；ZFJ-30B型中草藥粉碎機(江陰市普友粉體設(shè)備有限公司)；SHZ-3循環(huán)水多用真空泵(上海青浦滬西儀器廠)；RE-5205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞東生化儀器廠)；COOL SAFE 95-15型冷凍干燥機(北京博醫(yī)康技術(shù)有限公司)；ZW-AZ型微量振蕩器(常州國華電器有限公司)；0408-2型臺式低速離心機(上海醫(yī)療器械集團有限公司手術(shù)器械廠)；MCO-18AIC CO2型細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)；Synergy-HT型多功能酶標(biāo)儀(Bio-Tek公司)；IX-7型倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Corning公司)；ES-315型高壓滅菌鍋(日本Tomy Kogyo公司)。

2 方法

2.1 東方螻蛄醇提物的制備 將東方螻蛄干燥蟲體3kg粉碎后，用15倍量95%乙醇冷浸提取3次，所得乙醇合并后濃縮，石油醚脫脂得提取浸膏[7]。制備過程如圖2。

2.2 測試樣品配制 取20g東方螻蛄浸膏水溶后，上聚酰胺柱，依次用水及不同比例的含水甲醇洗脫，定量收集，分別濃縮純化后冷凍干燥，共得到12個部位的樣品，編號為GB01～GB12。

2.3 實驗樣品溶液配制 取樣品1mg，先用20 μL DMSO溶解，再用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋成質(zhì)量濃度分別為200.0μg/mL、66.7μg/mL、22.2 μg/mL、7.4μg/mL的樣品溶液。

2.4 陽性對照品溶液配制 取質(zhì)量濃度為1mg/mL的DPP溶液，用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基配制成質(zhì)量濃度分別為10.00μg/mL、3.33μg/mL、1.11μg/mL、0.37μg/mL的對照品溶液。

2.5 改良MTT法測試受試物對人類肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性 將3種人肝癌細(xì)胞株(HepG2、BEL7402、SMMC7721)分別置于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。細(xì)胞計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個/mL，接種于96孔板，每孔100μL，培養(yǎng)24h；分別在每孔中加入樣品溶液50μL，每個濃度至少設(shè)3個復(fù)孔，同時作陰性對照(DMSO)和陽性對照(DPP)，再培養(yǎng) 72h后，每孔加入10μL的MTT液(5mg/μL)，再置培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h，沿孔邊緣輕輕吸去每孔中的培養(yǎng)液；分別在每孔加入150μL 三聯(lián)液(10%SDS～5%異丁醇-0.012mol/L HCl)，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12h，在檢測波長為570nm，參比波長為630nm條件下，測定各孔的吸光度值，每組實驗重復(fù)4次。細(xì)胞抑制率(%)=(1-對照組平均A570值/實驗組平均A570值)×100%。細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)值由SigmaPlot 13.0軟件計算得到。

3 結(jié)果與分析

試驗結(jié)果表明，東方螻蛄醇提物用聚酰胺層析分離劃段所得的12個部位中，除編號為GB01～GB03及GB12的樣品對3種人類肝癌細(xì)胞株均無抑制作用外，GB04～GB11樣品至少對1種人類肝癌細(xì)胞株表現(xiàn)出細(xì)胞毒性；GB05～GB08樣品對3種人類肝癌細(xì)胞株都表現(xiàn)出較強的細(xì)胞毒活性(表1)。從同一個部位對不同人類肝癌細(xì)胞株的細(xì)胞毒活性來看，其抗腫瘤活性存在著差異，表明活性部位對不同腫瘤細(xì)胞的抑制(或殺滅)作用具有一定的選擇性。但從總體而言，所有具有細(xì)胞毒活性的分離部位對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒活性都強于BEL7402細(xì)胞和SMMC7721細(xì)胞；與陽性藥物順鉑相比，其中高活性部位(如GB07和GB08)的IC50值已達(dá)到陽性藥物的35%，具有較理想的細(xì)胞毒活性。

表1 東方螻蛄醇提物GB01～GB12樣品對所測試3種人類肝癌細(xì)胞株的IC50值

表中數(shù)據(jù)為4次重復(fù)實驗的平均值；“-”表示IC50>100 mg/L或無抑制作用，表中未列出具體數(shù)據(jù)。

4 討論

螻蛄是農(nóng)業(yè)害蟲，能大量啃食植物根部，造成其大片萎蔫，直至死亡。我國螻蛄資源豐富，以其入藥的組方在多種醫(yī)藥典籍中均有記載，各地民間也有廣泛的應(yīng)用[8-10]。歐洲螻蛄的提取物被用于治療傷口和燒傷，而東方螻蛄的提取物被用于治療膿腫和潰瘍[11]。張頌等[12]研究表明，給小鼠飼喂螻蛄粉5 g /d，連續(xù)1個月；家兔0.5 g /( kg·d) ，連續(xù)2個月，均未見毒性反應(yīng)。小鼠發(fā)育正常，雌鼠正常懷孕，幼鼠發(fā)育良好。家兔體重、白細(xì)胞計數(shù)、血紅蛋白含量測定、尿蛋白及沉淀檢查均未發(fā)現(xiàn)異常。Ahn等[13]通過染料吸收法研究螻蛄提取物對人類子宮頸癌HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒性，結(jié)果表明螻蛄提取物具有較強的L-氨基酸氧化酶活性，且對HeLa細(xì)胞具有較強的細(xì)胞毒性。筆者前期的實驗研究表明，東方螻蛄提取物對實驗動物具有明顯的利尿作用和一定的鎮(zhèn)靜作用[14]。張普照等[15]研究表明，螻蛄提取物對金黃色葡萄球菌和結(jié)核桿菌具有較明顯的抑菌活性。

目前，關(guān)于螻蛄提取物抗腫瘤活性的研究報道并不多見。楊義芳等[16]使用螻蛄不同極性提取部位對小鼠的實體瘤進(jìn)行篩選，藥效篩選結(jié)果表明，以乙醇提取后的石油醚部位的藥效最為明顯，經(jīng)有效成分富集的提取物對人類肝癌QGY細(xì)胞、腸癌LOVO細(xì)胞、肺癌A549細(xì)胞和小鼠S180細(xì)胞、肝癌H22細(xì)胞、肺癌Lewis細(xì)胞均有明顯的抗腫瘤作用，量效關(guān)系明顯。魏道智等[17]分析和測定了東方螻蛄的化學(xué)成分，通過體外試驗表明，東方螻蛄提取物對人體的癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，但未對其有效部位、有效劑量進(jìn)行深入的研究。本研究采用乙醇冷浸法對東方螻蛄干燥品粉碎物進(jìn)行提取，通過聚酰胺柱層析分離劃段得到東方螻蛄醇提物的不同部位，共獲得12個樣品。研究發(fā)現(xiàn)，東方螻蛄醇提物不同活性部位的抗腫瘤活性存在著一定的差異。

MTT法又稱MTT比色法，是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種快速、簡便的體外抗腫瘤藥物的細(xì)胞毒性測試方法，目前已被廣泛用于抗腫瘤藥物體外活性篩選試驗。MTT法的檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經(jīng)濟。一般來說，中藥抗腫瘤部位活性測試IC50值小于10.0 μg/mL時就值得進(jìn)一步研究[18]。據(jù)此可見，東方螻蛄提取物中確實存在具有腫瘤細(xì)胞生長抑制(或殺滅)作用的活性物質(zhì)。

近年來與螻蛄相關(guān)的各項藥學(xué)研究逐漸成為熱點。但是，螻蛄有些化學(xué)成分尚不明確，藥理與體內(nèi)作用機制及臨床應(yīng)用的研究也需深入研究。此外，螻蛄是一種昆蟲類藥材，其毒副作用的研究也應(yīng)予以重視?？梢灶A(yù)見的是，隨著各方面研究水平的不斷提高，螻蛄很有可能成為一種極具前途、應(yīng)用更加廣泛的昆蟲類中藥材。

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Study on Human Liver Cancer Cells Cytotoxicity of Ethanol Extracts of G. orientallis Burmeister

YANG Yongqin1ZHANG Chenggui2ZI Jiaji1DING Xiaoqian1YANG Zefang1YU Min3XIONG Wei1,2*

1. Pre-clinical College, Dali University, Dali 671000, China;2. Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D, Dali 671000, China;3. School of Life Sciences,Yunnan University, Kunming 650091, China

Objective To study the in vitro anti-tumor activity of ethanol extracts from G. orientallis Burmeister by cytotoxicity assay on three liver cancer cells(HepG2、BEL7402、SMMC7721). Methods Extracts of G. orientallis Burmeister are prepared by ethanol cold-maceration method. The samples are prepared with polyamide column chromatography separation of extracts of G. orientallis Burmeister and the cytotoxicity of samples with MTT assaying. Results There are 2 samples have strong cytotoxicity and some of them have IC50 lower than 10.0 μg/mL. There are anti-tumor activity compouds in extracts of G. orientallis Burmeister by comparison the cell cytotoxicity results. Conclusion Extracts of G. orientallis Burmeister inhibit the growth of human liver cancer cells in vitro and it merits further research.

G. orientallis Burmeister；Extracts；Liver Cancer Cell；MTT；Cytotoxicity

云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室開放課題(201617)；云南省中青年學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人后備人才項目(第十九批)。

楊勇琴，女，碩士研究生，講師，研究方向為昆蟲生物醫(yī)藥的開發(fā)與研究。E-mail:yangyongqin1979@163.com

熊偉，男，博士研究生，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為腫瘤細(xì)胞分子生物學(xué)。E-mail: xwailp@163.com

R285.5

A

1007-8517(2017)15-0066-04

2017-04-22 編輯：陶希睿)