單細(xì)胞多重替代擴(kuò)增法結(jié)合比較基因組雜交技術(shù)檢測植入前發(fā)育停滯胚胎染色體非整倍性

石青青，孫海翔

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 婦產(chǎn)科，江蘇 南京 210008)

胚胎染色體的非整倍性改變可影響胚胎的發(fā)育［1］。臨床上很多體外授精的胚胎在植入前體外培養(yǎng)的過程中即出現(xiàn)發(fā)育停滯，使用標(biāo)準(zhǔn)的形態(tài)學(xué)方法很難鑒別此胚胎染色體是否為非整倍性染色體，這需要使用植入前遺傳學(xué)診斷技術(shù)來鑒定［2－3］。比較基因組雜交(comparative genomic hybridization，CGH)技術(shù)是在熒光原位雜交(fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的的一種分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，僅需少量DNA 經(jīng)過一次雜交就可以對全基因組進(jìn)行全面的評估，該技術(shù)還無需細(xì)胞培養(yǎng)和預(yù)先了解需檢測的染色體區(qū)域，但臨床上為了減少胚胎的損傷，僅能取單個卵裂球進(jìn)行PGD 檢測，而單個卵裂球所包含的DNA量有限，不足以用于CGH 檢測。全基因組擴(kuò)增(whole genome amplification，WGA)技術(shù)是一種非選擇性擴(kuò)增全基因組DNA 序列的技術(shù)，它能如實反映基因組全貌，并對DNA 大量復(fù)制［4］。本次研究應(yīng)用WGA 技術(shù)中穩(wěn)定性強(qiáng)、特異性高、保真性好的多重置換擴(kuò)增法(MDA)結(jié)合CGH 技術(shù)對70枚植入前發(fā)育停滯卵裂球進(jìn)行檢測，篩查植入前胚胎非整倍性染色體，分析植入前發(fā)育胚胎發(fā)育停滯的病因機(jī)制。

1 對象和方法

1.1 研究對象

從生殖中心2011 年植入前6 ～8 細(xì)胞期發(fā)育停滯的胚胎中，隨機(jī)選取70 枚，通過透明帶激光打孔輔助卵裂球吸拉法，每枚胚胎各取出卵裂球一枚，分別放入0.5 mL PCR 管內(nèi)。正常男性肝素抗凝新鮮外周血2 mL，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離得到單個核淋巴細(xì)胞，梯度稀釋于生理鹽水內(nèi)，于倒置顯微鏡下挑取單個淋巴細(xì)胞，放入0.5 mL PCR 管內(nèi)，待用。

1.2 方法

1.2.1 MDA 和染色體標(biāo)本制備 MDA 及其產(chǎn)物檢驗試劑(single cell WGA kit)購于美國Sigma 公司，步驟:(1)裂解細(xì)胞，去離子水9 μL 及新鮮制備的裂解緩沖液1 μL(包含蛋白酶K 及10×單細(xì)胞裂解緩沖液)，PCR 程序，50 ℃、1 h，99 ℃、4 min;(2)模板制備，1×單細(xì)胞模板制備緩沖液2 μL及模板穩(wěn)定液1 μL，PCR 反應(yīng)，95 ℃、2 min，置于冰上冷卻，加入模板制備酶1 μL，PCR，16 ℃、20 min，24 ℃、20 min，37 ℃、20 min，75 ℃、5 min，4 ℃、10 min;(3)擴(kuò)增，加入10×擴(kuò)增混合液7.5 μL，去核酸水48.5 μL，WGA DNA 聚合酶5 μL;PCR，95 ℃、3 min，94 ℃、30 s，65 ℃、5 min，共25 個循環(huán);4 ℃、10 min。通過比色法及1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗擴(kuò)增結(jié)果，用常規(guī)方法制備正常男性淋巴細(xì)胞中期染色體。(此為Sigma 公司MDA 商品化試劑盒內(nèi)的試劑，以及試劑盒內(nèi)附操作步驟)

1.2.2 CGH 雜交 (1)單細(xì)胞WGA 產(chǎn)物沉淀:在擴(kuò)增產(chǎn)物PCR 管中加入3 mol/L NaAc 5 μL，－20℃無水乙醇125 μL，混合均勻后瞬時離心，放入－70 ℃沉淀1 h。4 ℃12 000 r/min 離心30 min，吸去上清液，用75%乙醇洗滌沉淀2 次。4 ℃12 000 r/min 離心5 min，吸去上清液。于空氣中干燥。(2)DNA 切口平移與熒光標(biāo)記:50 μL 體系，沉淀DNA 的PCR 管內(nèi)加入10×PolyI buffer 5 μL，dTTP 5 mL，dNTP 10 μL，PolyI 2 μL，Spectrum Green/Spectrum Red dUTP 2.5 μL，DnaseI 1 μL，去離子水24.5 μL。漩渦振蕩混勻后瞬時離心，15 ℃酶切，片段大小集中在250 ～750 bp，PCR 儀上70 ℃10 min 終止反應(yīng)。單個卵裂球擴(kuò)增產(chǎn)物標(biāo)記綠色熒光作為待測樣本，正常男性外周血單個淋巴細(xì)胞擴(kuò)增產(chǎn)物均標(biāo)記了紅色熒光作為對照樣本。(3)雜交:兩種標(biāo)記探針各取30 μL，混合后加入人類Cot－1 DNA 10 μL，3 mol/L 醋酸鈉5 μL、無水乙醇125 μL，充分混勻，－80 ℃沉淀1 ～2 h。4 ℃12 000 r/min 離心30 min，用75%乙醇洗滌沉淀，吸去上清液，于空氣中干燥。探針溶于10 μL 雜交緩沖液(50%去離子甲酰胺，2×SSC，10%硫酸葡聚糖、pH=7.0)，將探針和染色體玻片共變性73 ℃5 ～6min;37 ℃孵育箱中雜交48 ～72 h 雜交。(4)洗片及分析:0.1%NP40/2×SSC，37 ℃，洗片3 min;在黑暗中常溫干燥;加抗熒光淬滅DAPI 30 μL。(5)CGH 圖像的獲取以及分析Lecia 熒光顯微鏡下選擇中期染色體分散，信號光滑背景較低的區(qū)域用ASI 分析軟件進(jìn)行分析，每一染色體上綠紅2 種信號疊加后會形成一定的熒光強(qiáng)度比(FR)，通過分析熒光強(qiáng)度比，即可制作出CGH 拷貝數(shù)核型模式圖，正常染色體的綠紅比值為0.85 ～1.15，綠紅比值≤0.75 時判斷為染色體丟失，≥1.25 時判斷為染色體擴(kuò)增。

2 結(jié)果

在檢測的70 枚卵裂球中，有7 枚出現(xiàn)染色體的非整倍性改變，其中2 枚卵裂球染色體為46，XY，dup(Y)(q12);其余5 枚卵裂球的染色體分別為45，X;47，XY+21;47，XY+1;46，XY，dup(17)(q23);46，XX，dup(20)(p12)。染色體異常的發(fā)生率為10%。見圖1。

3 討論

自1993 年Munné 對人類胚胎非整倍性篩查開始至今，很多體外授精病人的妊娠失敗都是由于胚胎的非整倍性造成的［5－6］。但是不同類型的染色體非整倍性改變對胚胎發(fā)育的影響不同，并且染色體非整倍性改變出現(xiàn)在胚胎發(fā)育的不同階段對于胚胎發(fā)育的影響也不同。在人類活產(chǎn)嬰兒中，13、18、21 和性染色體的非整倍體改變占染色體數(shù)目異常的95%。對于植入后發(fā)育停滯胚胎進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，常染色體三體改變最為常見，其中15、16及22 號染色體3 體異常發(fā)生率較高，其次為性染色體單體改變及結(jié)構(gòu)重排［7－8］;還有一部分胚胎在著床前體外培養(yǎng)時就會出現(xiàn)發(fā)育停滯的現(xiàn)象。本研究立足于染色體的非整倍性改變，通過MDA 結(jié)合CGH 方法對植入前即發(fā)育停滯的胚胎進(jìn)行檢測，以期發(fā)現(xiàn)這種發(fā)育停滯是否與染色體的非整倍性有關(guān)，以及何種類型的染色體非整倍性改變可以引起胚胎在植入前發(fā)育停滯。

本研究的70 枚植入前發(fā)育停滯的卵裂球中，7枚出現(xiàn)染色體非整倍性改變，且非整倍性改變的類型各不相同，染色體異常的發(fā)生率為10%，表明本研究中染色體異常的發(fā)生比例較高，且非整倍性改變的類型與既往研究的妊娠胚胎發(fā)育異常的類型不同［9］。本次研究挑選6 ～8 細(xì)胞期的胚胎卵裂球，最大限度降低了染色體嵌合現(xiàn)象(即同一胚胎的不同卵裂球中的染色體組成不一致的現(xiàn)象)引起的異常染色體的漏檢。本次研究的不足是CGH技術(shù)，檢測擴(kuò)增和缺失的靈敏度約為2 Mb，一些微小的擴(kuò)增或缺失無法檢測，導(dǎo)致實際染色體非整倍性改變比例應(yīng)高于檢測比例。因此，植入前發(fā)育停滯的胚胎中的胚胎存在染色體非整倍性改變比例應(yīng)高于10%，說明染色體非整倍性改變可能導(dǎo)致植入前胚胎的發(fā)育停滯。

圖1 植入前發(fā)育停滯卵裂球染色體非整倍性改變Fig.1 Chromosome aneuploidy of blastomeres of arres ted development before implantation

胚胎發(fā)育停滯原因復(fù)雜，與自然妊娠的胚胎發(fā)育停滯不同，植入前胚胎發(fā)育停滯可能與下列因素有關(guān):(1)氧自由基傷害，胚胎在早期對于外源性氧化損傷的敏感性很高，自身抗氧化保護(hù)的機(jī)制發(fā)育尚未完全;有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，用胚胎在體外培養(yǎng)時，培養(yǎng)液中活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)增高后可引起小鼠早期胚胎發(fā)育阻滯，當(dāng)外源性地補(bǔ)充抗氧化的酶類后，就可以避免體外培養(yǎng)和操作帶來的ROS 損害［10－11］;(2)培養(yǎng)液成分不平衡，與體細(xì)胞不同，早期胚胎發(fā)育代謝機(jī)制具有其特殊性;體內(nèi)環(huán)境中不同的養(yǎng)分以不同的量和形式存在，它們彼此保持著一定的平衡關(guān)系，也正是這種平衡體系為胚胎發(fā)育提供了適合的發(fā)育環(huán)境;培養(yǎng)液平衡體系一旦打破，那勢必會影響胚胎的發(fā)育;阻滯就不可避免;(3)胚胎冷凍損傷，主要認(rèn)為是由于胚胎的線粒體等受損從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，造成胚胎發(fā)生阻滯［12－14］。

本次研究成功應(yīng)用單細(xì)胞MDA 結(jié)合CGH 技術(shù)對植入前胚胎全基因進(jìn)行檢測，篩選出植入前胚胎非整倍性的染色體，表明染色體非整倍性改變可能是植入前胚胎的發(fā)育停滯的原因之一。

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