飲用水有機(jī)提取物對(duì)大鼠氧化應(yīng)激及免疫功能的影響*

桂曉玲，岑延利，楊光紅＊，敖云霞，李 騫，王士然

(貴州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004)

目前我國(guó)水環(huán)境污染狀況不容樂(lè)觀。由于工業(yè)廢水、生活污水的大量排放及飲用水氯化消毒副產(chǎn)物的生成，使飲用水有機(jī)物污染成為了重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。水體中的有機(jī)物分布廣泛，具有毒性大、難降解、生物富集等特點(diǎn)，能夠通過(guò)長(zhǎng)期積累達(dá)到危害人類及其他生物的水平，主要干擾神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)功能等，有的還能在組織內(nèi)部改變和破壞細(xì)胞的DNA 結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生致癌作用［1］。課題組的前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，某地飲用水存在有機(jī)物污染，居民存在不孕不育、消化系統(tǒng)慢性病相對(duì)高發(fā)等健康問(wèn)題［2］。課題組萃取當(dāng)?shù)仫嬘盟袡C(jī)污染物，復(fù)制動(dòng)物模型后證實(shí)該地飲用水有機(jī)污染物具有致突變性和雄性生殖毒性［3－4］。本實(shí)驗(yàn)將在課題組既往研究基礎(chǔ)上，從氧化應(yīng)激和免疫功能的角度研究當(dāng)?shù)仫嬘盟袡C(jī)污染物對(duì)機(jī)體的損害，為當(dāng)?shù)仫嬘盟l(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)及肝臟毒性影響提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 免疫球蛋白(IgM、IgG、IgA)試劑盒與補(bǔ)體(C3、C4)試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)，超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)測(cè)試盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH－Px)測(cè)試盒、丙二醛(Malond－ialdehyde，MDA)測(cè)試盒(南京建成生物工程有限公司)。二氯甲烷、甲醇(色譜純，美國(guó)TEDIA 公司)，XAD－2 大孔樹(shù)脂(粒度60－80 目，美國(guó)TEDIA 公司)，玉米油(美國(guó)Sigma 公司)。主要實(shí)驗(yàn)儀器有RE－3000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器有限公司)，SHB－Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)公司)，SC－1 型離心機(jī)(美國(guó)KOCOUR 公司)，AR1530/C 電子天平(美國(guó)奧斯豪公司)，721 分光光度計(jì)(山東高密彩虹分析儀器有限公司)，AU400 型全自動(dòng)生化分析儀(日本奧林巴斯公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo 公司)。

1.2 水樣采集及有機(jī)物提取 于2012 年7 ～9 月(豐水期)采集G 市某地管網(wǎng)末梢水水樣20 000 L，利用固相萃取法提取水樣中有機(jī)污染物［5］。將揮干濃縮后的有機(jī)提取物用玉米油定容至50 L/mL(每1 mL 溶液中含有50 L 水的有機(jī)提取物)，于4℃冰箱保存，備用。

1.3 動(dòng)物模型制備 清潔級(jí)(Sprague Dawley)SD大鼠40 只，雌雄各半，體質(zhì)量80 ～100 g，由中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)提供，合格證號(hào)SCXK(渝)2012－0003。染毒前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，清潔級(jí)動(dòng)物房相對(duì)濕度50%－70%，溫度(23±2)oC。40 只SD 大鼠按隨機(jī)區(qū)組法分為對(duì)照組、高中低劑量組4 組，每組10 只，雌雄各半。對(duì)照組給予玉米油、其余低中高劑量組根據(jù)參考文獻(xiàn)［6］分別給予5、20 及80 L/kg 進(jìn)行灌胃染毒，灌胃體積為10 mL/kg，1 次/d，每周染毒5 d，連續(xù)12 周。最后一次染毒結(jié)束后，用0.9%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，采集股動(dòng)脈血與肝臟，制備血清及肝勻漿，于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 抗氧化酶、氧化產(chǎn)物、免疫球蛋白及補(bǔ)體檢測(cè)取已制備的血清和肝勻漿。采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定血清與肝勻漿中SOD 活性。采用微量酶標(biāo)法測(cè)定血清及肝勻漿中GSH－Px 的活性。采用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定血清及肝勻漿MDA 的含量。采用透射比濁法檢測(cè)血清免疫球蛋白(IgM、IgG、IgA)與補(bǔ)體(C3、C4)的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析(one－way ANOVA)，組間兩兩比較用LSD 檢驗(yàn)或Games－Howell 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清及肝組織SOD、GSH－Px 活力及MDA 含量 與對(duì)照組相比，血清SOD 活力在低劑量組明顯升高、高劑量組明顯降低，GSH－Px 活力在高劑量組明顯下降，MDA 含量在中、高劑量組均明顯升高;肝組織SOD 活力僅在高劑量組降低，GSH－Px 活力則在中、高劑量組都顯著降低，MDA含量在中、高劑量組均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 大鼠血清及肝組織SOD、GSH－Px 活力及MDA 含量(n=10Tab.1 The enzyme activities of SOD，GSH－Px in rat serum and liver tissues exposed to organic extracts from drinking water(n=10)

表1 大鼠血清及肝組織SOD、GSH－Px 活力及MDA 含量(n=10Tab.1 The enzyme activities of SOD，GSH－Px in rat serum and liver tissues exposed to organic extracts from drinking water(n=10)

(1)同類型樣本對(duì)照組比較，P ＜0.05

組別SOD(U/mL prot)GSH－血Px清(U/mL prot)MDA(μmol/L)SOD(U/mL prot)GSH－肝Px臟(U組/m織L prot)MDA(μmol/L)對(duì)照組 186.51±18.39 307.35±24.95 5.48±1.34 329.94±30.68 111.24±11.46 11.46±1.66低劑量組 209.78±24.06(1)325.67±32.77 5.61±1.19 341.94±43.48 124.49±15.76 11.77±2.26中劑量組 175.04±13.98 286.12±37.09 8.10±1.41(1) 287.63±18.93 88.40±13.90(1) 17.92±2.41(1)高劑量組 158.03±19.63(1)238.49±37.09(1)12.34±2.07(1) 261.35±35.56(1) 74.12±14.91(1) 25.56±5.81(1)

2.2 大鼠免疫功能 隨著染毒劑量的增加，中、高劑量組的IgM 含量較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);IgA、IgG、C3及C4則無(wú)明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見(jiàn)表2。

表2 飲用水有機(jī)提取物對(duì)大鼠免疫功能的影響(n=10Tab.2 The effect of organic extracts from drinking water on rat immune function

表2 飲用水有機(jī)提取物對(duì)大鼠免疫功能的影響(n=10Tab.2 The effect of organic extracts from drinking water on rat immune function

(1)同指標(biāo)對(duì)照組比較，P ＜0.05

組別 n IgA免疫球蛋I白gG(×10－3)IgM C3補(bǔ)體(×10－3)C4對(duì)照組 10 0.22±0.13 1.30±2.60 10.40±4.20 47.00±7.00 7.60±2.00低劑量組 10 0.23±0.18 2.00±1.00 10.00±4.00 54.30±10.00 7.80±2.00中劑量組 10 0.24±0.19 1.80±0.70 86.00±5.00(1) 54.90±9.60 9.00±3.30高劑量組 10 0.28±0.13 1.70±0.60 103.80±2.90(1)59.10±3.30 9.40±3.90

3 討論

有研究認(rèn)為，在飲用水有機(jī)污染物的肝毒性機(jī)制研究中，脂質(zhì)過(guò)氧化作用可能發(fā)揮了重要作用［7］。正常生理狀態(tài)下，機(jī)體產(chǎn)生自由基與清除自由基的能力處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體自由基產(chǎn)生過(guò)多時(shí)，機(jī)體的抗氧化酶可清除多余的自由基，以保證細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過(guò)氧化物的干擾及損害，其主要的抗氧化酶有SOD、GSH－Px 等。MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，反映了脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。因此，聯(lián)合測(cè)定SOD、GSH－Px 及MDA 可以反映外源化學(xué)物對(duì)機(jī)體氧化系統(tǒng)的損害程度。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低劑量飲用水有機(jī)物接觸均可誘導(dǎo)SOD 及GSH－Px 活力升高，而中、高劑量接觸則可抑制肝組織及血清的SOD、GSH－Px 活力。其原因可能為肝細(xì)胞受到自由基攻擊后，作為一種自身保護(hù)性機(jī)制，肝臟內(nèi)抗氧化酶活性代償性增加;但隨著染毒劑量的增大，產(chǎn)生的自由基過(guò)多，消耗大量抗氧化酶，致SOD、GSH－Px 含量減少，活性降低。因此，中、高劑量組MDA 相應(yīng)升高(P ＜0.05)。提示該地飲用水有機(jī)污染物隨接觸劑量增加，可抑制大鼠肝臟抗氧化酶的活性、削弱其阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化鏈鎖反應(yīng)的能力，從而導(dǎo)致大鼠肝臟的氧化損傷加劇。這可能是該地飲用水有機(jī)污染物致肝臟毒性的重要機(jī)制之一。這與羅皓等［8］的氯化飲水有機(jī)提取物對(duì)HepG2 細(xì)胞具有明顯的脂質(zhì)過(guò)氧化作用相一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，同一染毒劑量組中，血清中抗氧化酶活性及氧化產(chǎn)物水平與肝組織中各指標(biāo)的變化趨勢(shì)一致，提示血清學(xué)氧化應(yīng)激指標(biāo)可在今后飲用水有機(jī)污染物暴露人群肝臟氧化損傷的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)中進(jìn)行應(yīng)用。

血清免疫球蛋白IgG、IgA、IgM 是體液免疫的分子基礎(chǔ)，行使特異性免疫功能。其中IgG 是生物體液內(nèi)最主要的免疫球蛋白［9］，由于IgG 較其他類球蛋白更易擴(kuò)散到血管外的間隙內(nèi)，因而在結(jié)合補(bǔ)體、增強(qiáng)免疫細(xì)胞吞噬病原微生物和中和細(xì)菌毒素的能力方面，具有重要作用，能有效地抗感染，這是對(duì)機(jī)體有利的一面，但某些自身免疫病，如自身免疫性溶血性貧血、血小板減少性紫癜、紅斑狼瘡以及類風(fēng)濕的自身抗體都是IgG，一旦它與相應(yīng)的自身細(xì)胞結(jié)合，反而加強(qiáng)了組織損傷作用。IgA 在血清中的含量?jī)H次于IgG，按其免疫功能又分為血清型及分泌型兩種，血清型IgA 雖有IgG 和IgM 的某些功能，但在血清中并不顯示重要的免疫功能。IgM 在免疫球蛋白中分子量最大，通常稱為巨球蛋白，IgM 是初次體液免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的抗體，是機(jī)體抗感染抗損傷的“先頭部隊(duì)”;血清中檢出IgM 提示新近發(fā)生感染或出現(xiàn)新的損傷，可用于感染或新發(fā)損傷的早期診斷［10］。除此之外，IgG、IgA、IgM 還可激活補(bǔ)體(C3、C4)傳統(tǒng)途徑，參與機(jī)體的非特異性免疫［11］。本研究將飲用水有機(jī)提取物亞慢性染毒SD 大鼠后，發(fā)現(xiàn)中、高劑量組IgM 含量明顯升高(P ＜0.05);IgA、IgG、C3及C4各染毒組與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，表明該地飲用水有機(jī)提取物作為外源性抗原進(jìn)入大鼠機(jī)體后，大鼠即啟動(dòng)免疫應(yīng)答，IgM 抗體含量明顯升高。提示該地飲用水有機(jī)提取物主要誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)的初次免疫應(yīng)答增強(qiáng)，而對(duì)機(jī)體的再次免疫應(yīng)答及非特異性免疫無(wú)明顯誘導(dǎo)作用。

飲用水有機(jī)污染物暴露導(dǎo)致的氧化損傷、免疫應(yīng)答異常可能成為消化系統(tǒng)疾病相對(duì)高發(fā)的重要原因之一。但由于本實(shí)驗(yàn)為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，尚需進(jìn)一步的進(jìn)行人群流行病學(xué)調(diào)查進(jìn)行支撐。

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