響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取佛手瓜總黃酮的工藝研究

陳建福 ， 林 洵 ， 陳美慧 ， 周媚媚

（1.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，福建 漳州 363000；2.閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，福建 漳州 363000；3.農(nóng)產(chǎn)品深加工及安全福建省高校應(yīng)用技術(shù)工程中心，福建 漳州 363000）

佛手瓜[Sechium edule（Jacq.）Swartz]又名安南瓜、隼人瓜等，是葫蘆科佛手瓜屬珍稀瓜類蔬菜（Ordo?eza 等，2006）。黃酮類化合物是一類廣泛存在于植物體中的多酚類物質(zhì)，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、降血壓、降血脂、延緩衰老等作用（Escriche 等，2014；Nakabayashi等，2014）。 本試驗(yàn)對(duì)影響超聲波輔助提取佛手瓜總黃酮的工藝條件進(jìn)行了研究，并利用響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到了最佳的工藝條件，為佛手瓜資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 佛手瓜，購(gòu)于漳州西洋坪菜市場(chǎng)。乙醇，分析純，使用時(shí)，配制成不同濃度（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇溶液；蘆丁，標(biāo)準(zhǔn)品；硝酸鋁，分析純；亞硝酸鈉，分析純；氫氧化鈉，分析純。

SCQ-3201E超聲波清洗機(jī)，上海聲彥超聲波有限公司；LGJ10-C冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；Q-250B高速多功能粉碎機(jī)，上海冰都電器有限公司；UV-1800PC-DS2紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；BSA124S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；GZX-9070MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 佛手瓜總黃酮的測(cè)定 利用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定在波長(zhǎng)為510 nm時(shí)的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到吸光度與濃度的回歸方程（陳建福和施偉梅，2014）。

利用上述方法測(cè)定佛手瓜提取液的吸光度，代入回歸方程，得到總黃酮濃度，利用下式換算得到總黃酮提取率。

式中：m為佛手瓜的質(zhì)量，g；b為回歸方程計(jì)算的總黃酮質(zhì)量濃度，mg/L；V為提取液體積，L。

1.2.2 超聲波輔助提取佛手瓜總黃酮 將佛手瓜洗凈切成條狀，并泡于蒸餾水中0.5 h，撈起自然晾干后，冰凍，并于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥，粉碎，過80目篩備用。在裝有冷凝管的250 mL三口燒瓶中，裝入一定量的佛手瓜粉末，置于超聲波反應(yīng)器中，按照試驗(yàn)工藝條件對(duì)佛手瓜總黃酮進(jìn)行提取，結(jié)束后，濃縮，定容，按1.2.1中的方法對(duì)總黃酮提取率進(jìn)行計(jì)算。

1.3 單因素試驗(yàn) 固定其他條件不變，分別選取乙醇濃度（60%、65%、70%、75%、80%、85%）、超聲溫度 （60、65、70、75、80、85 ℃）、 液料比（15、20、25、30、35、40 mL/g）、超聲時(shí)間（15、20、25、30、35、40 min）等進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以總黃酮提取率為指標(biāo)，研究各因素對(duì)佛手瓜總黃酮提取率的影響。

1.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，選擇乙醇濃度（A）、超聲溫度（B）、液料比（C）、超聲時(shí)間（D）為工藝參數(shù)，運(yùn)用Design Expert 8.05b軟件，采用Box-Behnken中心組合原理設(shè)計(jì)試驗(yàn)，進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，建立響應(yīng)值與因素間的預(yù)測(cè)模型，以確定最佳的工藝條件，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)對(duì)佛手瓜總黃酮提取率的影響

2.1.1 乙醇濃度對(duì)佛手瓜總黃酮提取率的影響從表2可以看出，總黃酮提取率隨著乙醇濃度的增加而增大，當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)，總黃酮的提取率最大，當(dāng)乙醇濃度超過70%時(shí)，提取率反而又下降，這是因?yàn)辄S酮類物質(zhì)具有一定的醇溶性，隨著乙醇濃度的增加，黃酮類物質(zhì)在溶劑中的溶解能力增強(qiáng)，因此總黃酮提取率提高。當(dāng)乙醇濃度超過70%后，溶劑的極性變?nèi)?，部分?qiáng)極性的黃酮溶出阻力增加，使得黃酮類物質(zhì)提取率的下降（Zhang等，2011）。因此最佳的乙醇濃度選擇為70%。

表2 提取條件對(duì)總黃酮提取率的影響

2.1.2 超聲溫度對(duì)佛手瓜總黃酮提取率的影響從表2可以看出，總黃酮提取率隨著超聲溫度的升高而增大，當(dāng)超聲溫度為70℃時(shí)，總黃酮提取率最大，當(dāng)超聲溫度超過70℃時(shí)，提取率反而下降，這是因?yàn)殡S著超聲溫度的升高，提取體系的分子熱運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)，促進(jìn)了總黃酮與溶劑之間的擴(kuò)散與交換（Xie等，2014），從而使得總黃酮提取率增大，但當(dāng)超聲溫度超過70℃時(shí)，高溫會(huì)使黃酮類物質(zhì)破壞與分解，從而導(dǎo)致總黃酮提取率的下降。因此最佳的超聲溫度選擇為70℃。

2.1.3 液料比對(duì)佛手瓜總黃酮提取率的影響 從表2可以看出，總黃酮提取率隨著液料比的增加而增大，當(dāng)液料比為25 mL/g時(shí)，總黃酮提取率最大，當(dāng)液料比超過25 mL/g時(shí)，提取率反而下降，這是因?yàn)殡S著液料比的增大，佛手瓜顆粒內(nèi)外的濃度差增大，使得傳質(zhì)推動(dòng)力增加，促進(jìn)了黃酮從顆粒內(nèi)部溶出，而使得總黃酮提取率增大，當(dāng)液料比超過25 mL/g后，溶劑量過大，溶劑會(huì)增加超聲能量的損耗且會(huì)增加后序濃縮中黃酮的損失（A-boshora等，2015），而使得總黃酮提取率下降。因此，最佳的液料比選擇為25 mL/g。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)佛手瓜總黃酮提取率的影響從表2可以看出，總黃酮提取率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，當(dāng)超聲時(shí)間為30 min時(shí)，總黃酮提取率最大，當(dāng)超聲時(shí)間超過30 min時(shí)，提取率反而下降。這是因?yàn)殡S著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，佛手瓜顆粒中的黃酮類物質(zhì)逐漸溶出，使得總黃酮提取率增大，但超聲時(shí)間過長(zhǎng)，超聲會(huì)產(chǎn)生局部的高溫而造成部分黃酮類物質(zhì)的分解 （Teh和 Birch，2014），而導(dǎo)致總黃酮提取率的下降。因此最佳的的超聲時(shí)間選擇為30 min。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取佛手瓜總黃酮的工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 利用Design Expert 8.05b軟件對(duì)表3的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到了佛手瓜總黃酮提取率對(duì)乙醇濃度、超聲溫度、液料比和超聲時(shí)間的二次多項(xiàng)式回歸方程：

Y=3.35-0.12A+0.34B+0.13C+0.14D+0.18AB-0.047AC-0.13AD+0.05BC-0.017BD+0.002CD-0.3A2-0.61B2-0.57C2-0.48D2。

回歸模型的方差分析如表4所示。由表4可以看出，該回歸模型F=19.81，P＜0.0001，說明該模型極顯著，與試驗(yàn)擬合較好。失擬項(xiàng)P=0.3113＞0.05，差異不顯著，表明未知因素對(duì)本試驗(yàn)的干擾較小，殘差是由隨機(jī)誤差引起的。相關(guān)系數(shù)R2=0.9519，表明該模型有超過95%的試驗(yàn)值可用預(yù)測(cè)值來代替，說明預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間的相關(guān)性較好。從回歸方程的F值及P值可看出，一次項(xiàng)B、D，二次項(xiàng) A2、B2、C2、D2對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響極顯著（P ＜ 0.01），一次項(xiàng) A、C，交互項(xiàng)AB 對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著（P ＜ 0.05），交互項(xiàng) AC、AD、BD、CD 對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05），說明各因素與佛手瓜總黃酮提取率之間不是簡(jiǎn)單的一次線性關(guān)系，而是呈二次關(guān)系，影響因子的主效應(yīng)主次順序?yàn)椋撼暅囟?超聲時(shí)間>液料比>乙醇濃度。綜上所述，利用響應(yīng)面法建立的回歸模型擬合度高，可較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，因此可以用該模型預(yù)測(cè)和分析超聲輔助提取佛手瓜總黃酮的工藝條件。

2.2.2 響應(yīng)面分析 根據(jù)表3的結(jié)果作出的響應(yīng)面分析圖及等高線圖如圖1所示。從圖1可以看出，超聲溫度和超聲時(shí)間的曲線較陡，說明超聲溫度和超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響最為顯著；而液料比和乙醇濃度的曲線均較平緩，響應(yīng)值變化較小，說明液料比和乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響較小。分析可知，主次因素順序?yàn)槌暅囟龋境晻r(shí)間>液料比＞乙醇濃度。

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 提取工藝優(yōu)化及結(jié)果驗(yàn)證 在所選取的各因素條件范圍內(nèi)，通過Design Expert 8.05b軟件對(duì)二次回歸模型進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到超聲波輔助提取佛手瓜總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇濃度69.15%、超聲溫度71.27℃、液料比25.66 mL/g、超聲時(shí)間31.64 min，在此條件下，佛手瓜總黃酮提取率的最大理論值為3.420%。為了驗(yàn)證響應(yīng)面法的可靠性，并考慮到實(shí)際操作條件的便利性，將工藝條件修正為：乙醇濃度69%、超聲溫度71℃、液料比25 mL/g、超聲時(shí)間31 min。以此為條件進(jìn)行三次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得佛手瓜總黃酮平均提取率為3.402%，與理論預(yù)測(cè)值3.420%相差較小，相對(duì)誤差為0.526%，說明通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到的佛手瓜總黃酮的回歸模型擬合度高，具有實(shí)際的生產(chǎn)價(jià)值。該工藝與楊海濤（2008）報(bào)道的傳統(tǒng)的熱浸提法（乙醇濃度70%、料液比1∶20，溫度80℃，提取時(shí)間2 h）相比，提取率提高了12.69%，該工藝大大縮短了操作時(shí)間，且操作溫度低，具有明顯的成本優(yōu)勢(shì)，是一種高效快速提取佛手瓜總黃酮的方法。

表4 回歸模型方差分析

3 結(jié)論

試驗(yàn)利用BoX-behnken Design設(shè)計(jì)方案，運(yùn)用Design Expert 8.05b軟件對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，得到了佛手瓜總黃酮提取率與各因素間的四元二次回歸方程。根據(jù)回歸模型確定了超聲輔助提取佛手瓜總黃酮的最佳工藝參數(shù)為：乙醇濃度69%、超聲溫度71℃、液料比25 mL/g、超聲時(shí)間31 min。在該工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得佛手瓜總黃酮平均提取率為3.402%，與理論預(yù)測(cè)值（3.420%）相差較小，相對(duì)誤差為0.526%，說明通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到的佛手瓜總黃酮提取的工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

圖1 兩因素交互作用對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖

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