8株木霉菌對(duì)橡膠樹(shù)紅根病的拮抗作用

秦云霞等

農(nóng)業(yè)部橡膠樹(shù)生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南儋州 571737）

摘 要 木霉菌具有抑制植物病原真菌生長(zhǎng)的能力，因而成為開(kāi)發(fā)土傳根部病害生防菌的首選之一。利用對(duì)峙培養(yǎng)法，測(cè)定8個(gè)木霉菌菌株對(duì)3個(gè)橡膠樹(shù)紅根病病原真菌的體外拮抗作用，并對(duì)篩選出來(lái)的木霉菌進(jìn)行相互間的對(duì)峙培養(yǎng)分析。結(jié)果表明：有6個(gè)木霉菌對(duì)3個(gè)紅根病病原菌具有顯著拮抗效果；所選出的6個(gè)木霉菌之間盡管多數(shù)可以共存，但存在空間和營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)，尤其是棘孢木霉，很容易被其它木霉菌抑制和侵占，因此，在今后使用時(shí)不適宜混配。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為進(jìn)一步篩選和利用生防菌防治橡膠樹(shù)根部病害提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 木霉菌 ；拮抗作用 ；橡膠樹(shù)紅根病 ；生物防治

分類(lèi)號(hào) S794.1 ；S476+.1

Abstract Trichoderma spp. has capacities of inhibiting or killing many pathogenic fungi， which make them one of the most promising bio-control agents of many soil-borne pathogens. In this study， the antagonistic effects of eight strains of Trichoderma on the soil-borne Ganoderma pseudoferreum， the pathogen of red root disease in Hevea brasiliensis， were tested with duel culture in vitro， as well as tested the mutual competitive effects among different Trichoderma strains selected. The results showed that six strains demonstrated markedly inhibiting effects and speciality to different pathogen strains. Obvious competition on nutrient and space were observed among the strains of Trichoderma spp.， especially the strong inhibition of the Trichoderma asperellum strain by other ones. Therefore， it is not recommended to mix them for synergistic bio-control function in future applications. These preliminary results will help further screening and utilization of the bio-control agents in the management of soil-borne pathogens of Hevea brasiliensis root diseases.

Keywords Trichoderma spp. ； antagonistic function ； Hevea brasiliensis Ganoderma pseudoferreum ； biocontrol

橡膠樹(shù)紅根病病原菌為Ganoderma pseudoferreum （Wakef.） Over.et steinm[1-2]，具有寄主多[3]、潛伏期長(zhǎng)、在土壤中蔓延迅速[4]等特點(diǎn)。紅根病病原菌屬于真菌界擔(dān)子菌門(mén)，層菌綱，靈芝屬，它危害巴西橡膠樹(shù)根頸部，傳播速度很快[4]。紅根病菌主要依靠根系接觸傳染，也可通過(guò)風(fēng)雨和昆蟲(chóng)傳播[5]。橡膠樹(shù)紅根病在我國(guó)各植膠區(qū)內(nèi)發(fā)生普遍，感染嚴(yán)重的林段發(fā)病率可達(dá)4.0%[4]，若沒(méi)有及時(shí)處理，死亡率可達(dá)100%[6]。橡膠樹(shù)根病的調(diào)查需要大量人力勞動(dòng)，早期跟蹤調(diào)查工作不到位，普查效率低。而當(dāng)橡膠樹(shù)地上部出現(xiàn)明顯的病癥時(shí)，已侵染發(fā)病嚴(yán)重，防治成本高且防效差。此病害的防治措施主要是采用化學(xué)防治和機(jī)械挖除[7-9]。2010年，尼日利亞N. O. Ogbebor等[10]開(kāi)始篩選生防菌（包括木霉菌）用于防治橡膠樹(shù)紅根病，但至今還未見(jiàn)防治效果的報(bào)道，國(guó)內(nèi)也未見(jiàn)利用木霉菌防治橡膠樹(shù)根病的報(bào)道。但是，近20年來(lái)，利用木霉菌進(jìn)行根病防治的工作在多種經(jīng)濟(jì)和糧食作物上迅速展開(kāi)，例如楊樹(shù)[11]，水稻[12]，中草藥[13]，西瓜[14]等。因此，分離篩選具有拮抗橡膠樹(shù)紅根病的生防木霉菌，對(duì)橡膠樹(shù)根病綜合防控措施的合理制定具有指導(dǎo)作用，有利于橡膠樹(shù)種植業(yè)的持久、安全發(fā)展。

木霉菌（Trichoderma spp.）是一類(lèi)重要的多功能益生真菌，廣泛存在于自然界中，資源豐富，種類(lèi)眾多[15]，不僅能通過(guò)多種機(jī)制來(lái)控制病原菌的侵染和病害的發(fā)生，且還具有促進(jìn)作物生長(zhǎng)、提高作物抗生物和非生物脅迫的能力[16-19]，是一種公認(rèn)的環(huán)境友好型真菌[20]。針對(duì)土傳病害具有潛伏期長(zhǎng)、危害大的特點(diǎn)，近年來(lái)篩選優(yōu)良木霉菌用于防治土傳病害的工作進(jìn)展很快[13，15，21]。

本文利用體外對(duì)峙實(shí)驗(yàn)[22]，選用具有拮抗多種植物病原菌能力的8株多功能木霉菌株[23]，鑒定其是否具有拮抗橡膠樹(shù)紅根病病原菌的效果。研究結(jié)果可為創(chuàng)制防治橡膠樹(shù)根部病害的新型生物農(nóng)藥奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

橡膠樹(shù)紅根病病原菌（G. pseudoferreum）菌株YN1、BT和DF采自不同橡膠種植區(qū)[24]，由本研究所種質(zhì)資源課題組提供；PDA平板保存于4℃冰箱，并定期復(fù)蘇培養(yǎng)。所用的8個(gè)木霉菌分別為ACCC31639、ACCC31642、ACCC31657、ACCC31637、ACCC31757、ACCC30536（棘孢木霉Tri.asperellum）、HCS和DJ1。其中，HCS為商業(yè)化的哈茨木霉產(chǎn)品（美國(guó)拜沃-哈茨木霉菌根部專用型殺菌劑），棘孢木霉ACCC30536購(gòu)自中國(guó)菌種網(wǎng)站（http：//www.mum800.com/），DJ1來(lái)自上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，由陳捷教授惠贈(zèng)；其余5個(gè)木霉菌均來(lái)自農(nóng)業(yè)部微生物資源收集與保藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，由顧金剛教授惠贈(zèng)，已證明這些菌株具有拮抗多種重要經(jīng)濟(jì)作物病原菌的能力，如棉花黃萎病菌（Verticilium dahliae）、番茄灰霉病菌（B. cinerea）等[23]。

1.2 方法

1.2.1 木霉菌、紅根病菌的復(fù)壯增殖培養(yǎng)

PDA培養(yǎng)基[24]，用于木霉菌和紅根病菌的復(fù)蘇培養(yǎng)以及木霉-病原菌對(duì)峙培養(yǎng)。

培養(yǎng)方法：在新鮮配置的PDA培養(yǎng)基上接種0.6 cm木霉菌和病原菌菌塊，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察和測(cè)量菌株的生長(zhǎng)直徑，并記錄和拍照，等木霉菌長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿，紅根病菌菌體長(zhǎng)至6 cm時(shí)，4℃低溫保存。

橡膠樹(shù)紅根病病菌的增殖培養(yǎng)方法：參照高秀兵等[25]對(duì)橡膠樹(shù)根病病原菌的培養(yǎng)方法，用曬干橡膠樹(shù)木屑 82%、麥麩15%、葡萄糖 2%、石膏粉 1%（質(zhì)量百分比）， 加水混勻至濕潤(rùn)，高溫滅菌后，放至室溫。在培養(yǎng)瓶中無(wú)菌接種病菌菌塊2～3個(gè)，并稍微壓實(shí)一下，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.2.2 對(duì)峙培養(yǎng)與抑菌率

在相同的PDA培養(yǎng)基上，與木霉菌生長(zhǎng)速度相比，紅根病病菌（G. Pseudoferreum）在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較慢（日平均生長(zhǎng)速度為0.5～1 cm），并且菌絲生長(zhǎng)稀薄，很容易呈現(xiàn)老化形態(tài)。為了更準(zhǔn)確鑒定木霉菌的拮抗效果，采用直徑0.6 cm的打孔器在新鮮配置的PDA培養(yǎng)基上打個(gè)孔，用滅菌后的小勺子把復(fù)壯培養(yǎng)好的紅根病菌填入到小孔中，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，等病菌直徑長(zhǎng)至約4 cm時(shí)，再打另外一個(gè)孔接種木霉菌，二者間隔2～3 cm，每個(gè)菌株重復(fù)接種3次。在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并定期觀察、記錄和拍照。定期測(cè)量紅根病病菌的生長(zhǎng)直徑，同時(shí)測(cè)量沒(méi)接種木霉菌的紅根病病菌的生長(zhǎng)情況（對(duì)照），計(jì)算抑制率。

抑菌率（%）=（對(duì)照組紅根病病菌的菌落半徑-處理組紅根病病菌的菌落半徑）×100/對(duì)照組紅根病病菌的菌落半徑。數(shù)據(jù)處理利用統(tǒng)計(jì)分析軟件DPS 7.5進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅根病病菌的生長(zhǎng)情況

選用橡膠木屑復(fù)壯培養(yǎng)病菌接種，紅根病病菌在PDA平板上菌絲體生長(zhǎng)致密，呈現(xiàn)亮白色，具旺盛生長(zhǎng)活力。表明利用橡膠木屑復(fù)壯培養(yǎng)的紅根病病菌生長(zhǎng)良好，可以應(yīng)用于后續(xù)的生防菌拮抗對(duì)峙實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖1。

2.2 8個(gè)木霉菌株的形態(tài)特征

根據(jù)木霉菌株在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)與產(chǎn)孢特性，HCS、DJ1、ACCC31757和ACCC31657屬于產(chǎn)孢型菌株，而其余4株屬于產(chǎn)絲型菌株，其不同的生長(zhǎng)特征見(jiàn)表1和圖2。

2.3 對(duì)峙分析

對(duì)峙培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，除了ACCC31637 和DJ1外，其余6個(gè)木霉菌都對(duì)3株紅根病菌均有顯著的拮抗效果，能夠在15 d內(nèi)抑制、侵占、甚至殺死紅根病病菌菌絲體。這6個(gè)木霉菌對(duì)3種橡膠樹(shù)紅根病菌的拮抗能力大小有一定差異，且整體上產(chǎn)絲型木霉菌比產(chǎn)孢型木霉菌抑制病菌生長(zhǎng)的能力更強(qiáng)（圖3，表2）。

從與DF對(duì)峙培養(yǎng)拮抗效果看，6個(gè)木霉菌的拮抗能力高低順序?yàn)椋篐CS>ACCC31657>ACCC30536>ACCC31639>ACCC31642>ACCC31757；從與BT對(duì)峙培養(yǎng)拮抗效果看，其拮抗能力順序?yàn)镠CS>ACCC31757>ACCC31639>ACCC31642>ACCC31657>ACCC30536；與YN1的拮抗能力順序?yàn)镠CS>ACCC31757>ACCC30536>ACCC31657>ACCC31642>ACCC31639。

從8個(gè)木霉菌與橡膠樹(shù)紅根病菌的對(duì)峙動(dòng)態(tài)分析中得知，經(jīng)過(guò)10 d的對(duì)峙培養(yǎng)，對(duì)3種紅根病菌的抑制率最低的是ACCC31637和DJ1，其余6個(gè)木霉菌對(duì)紅根病菌YN1的抑制率差異較大，為39%～100%，對(duì)BT和DF的抑制率差異小，分別為58.84%～100%和60%～100%。其中HCS、ACCC31757、ACCC31639、ACCC31642和ACCC31657 這5個(gè)木霉菌對(duì)紅根病BT株系的抑制率能達(dá)到100%；HCS和ACCC31757兩個(gè)木霉菌對(duì)紅根病YN1株系的抑制為100%；HCS和ACCC31657兩個(gè)木霉菌對(duì)紅根病DF株系的抑制率達(dá)100%。

2.4 木霉菌混配共生能力分析

木霉菌頑強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)生存能力是其拮抗能力的重要組成部分，在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)3種紅根病菌拮抗能力強(qiáng)的ACCC31639、ACCC31757、HCS和ACCC30536這四個(gè)木霉菌，分析其是否存在共生或抑制作用。在同一個(gè)平板上同時(shí)接種4個(gè)不同組合的木霉菌株（ACCC31639、ACCC31757、HCS和ACCC30536），培養(yǎng)4 d后，觀察和拍照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，棘孢木霉菌株ACCC30536的生存空間被其它3個(gè)木霉菌株侵占。其中，ACCC31639的競(jìng)爭(zhēng)能力很強(qiáng)，共培養(yǎng)4 d可以逐漸侵占HCS的生長(zhǎng)空間。盡管這些木霉菌之間一定程度上可共存，但相互間主要產(chǎn)生抑制，因此混合施用不同木霉菌來(lái)協(xié)同拮抗紅根病菌的做法效果可能不佳。見(jiàn)圖4。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所選用的8個(gè)木霉菌中，有6個(gè)木霉菌對(duì)3株橡膠樹(shù)紅根病病菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的體外拮抗能力，但不同木霉菌之間存在拮抗作用，所以，在今后的生產(chǎn)應(yīng)用中，不同木霉菌株不宜混配，應(yīng)主要考慮木霉菌與肥料、殺菌劑等其他成分的混配。據(jù)報(bào)道，海南橡膠樹(shù)紅根病病菌的性狀差異達(dá)到變種級(jí)水平，被分為類(lèi)型Ⅰ和類(lèi)型Ⅱ兩個(gè)不同變種[26]。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明6個(gè)木霉菌對(duì)3個(gè)紅根病病原菌的拮抗能力差異不大，間接表明所檢測(cè)的3個(gè)病原菌有可能屬于同一個(gè)變種類(lèi)型，因此，本文結(jié)果不能反映測(cè)試木霉菌菌株對(duì)橡膠樹(shù)紅根病病菌的綜合拮抗能力。在后續(xù)工作中，需要采集來(lái)源更廣泛的橡膠樹(shù)紅根病病菌菌株進(jìn)行測(cè)定，以期科學(xué)評(píng)估木霉菌菌株的體外拮抗能力與應(yīng)用前景。

體外對(duì)峙實(shí)驗(yàn)盡管是生防菌篩選的重要手段，但往往僅是篩選工作的第一步，生防菌田間施用后會(huì)受到土壤環(huán)境（特別是土著微生物）、根際定植、天氣和人為干預(yù)等眾多因素的影響。今后還需要在深入了解其生物學(xué)特征的基礎(chǔ)上，采用多種篩選方法繼續(xù)評(píng)估木霉菌的實(shí)際應(yīng)用效果[27]。例如檢測(cè)木霉菌在橡膠苗根際的定植能力、促生效果和大田應(yīng)用中對(duì)其他主要橡膠樹(shù)根病病原菌的拮抗實(shí)效等。同時(shí)，還需加強(qiáng)篩選在橡膠樹(shù)根際定殖的本地木霉菌株或其內(nèi)生木霉菌株，它們可能會(huì)具有更好的區(qū)域適應(yīng)性，深入了解木霉菌對(duì)橡膠根病病菌的拮抗機(jī)制，進(jìn)行木霉菌的誘導(dǎo)突變、菌株篩選與改良等。

致 謝 對(duì)上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院陳捷教授技術(shù)指導(dǎo)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所的顧金剛博士為本實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)菌株，并提出寶貴建議，在此一并致謝！

參考文獻(xiàn)

[1] 張運(yùn)強(qiáng)，張輝強(qiáng)，鄧曉東. 橡膠樹(shù)紅根病病原菌的鑒定[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，1997（1）：16-23.

[2] 張運(yùn)強(qiáng)，謝藝賢，張輝強(qiáng). 橡膠樹(shù)紅根病病原菌的鑒定（Ⅱ）[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2000，21（1）：20-24.

[3] 何 康，黃宗道. 熱帶北緣橡膠樹(shù)栽培[M]. 廣州市：廣東科技出版社，1987：498.

[4] 張運(yùn)強(qiáng)，張輝強(qiáng). 橡膠樹(shù)紅根病的蔓延速度及預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，1998（1）：7-12.

[5] 約 翰，陳楚蘋(píng). 橡膠樹(shù)根病的孢子傳播[J]. 世界熱帶農(nóng)業(yè)信息，1965（3）：13-15.

[6] 白建相，王 涓，黃 林，等. 云南河口墾區(qū)橡膠樹(shù)根病普查及治理方法探討[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科技，2008（4）：7-11.

[7] 詹興球，蔡江文. 75%十三嗎啉乳油防治橡膠紅根病田間藥效試驗(yàn)[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012（5）： 59-60.

[8] 李四有，邱學(xué)俊. 丙環(huán)唑防治橡膠樹(shù)紅根病田間試驗(yàn)[J]. 熱帶生物學(xué)報(bào)，2012（4）：325-328.

[9] 譚象生，范會(huì)雄. 橡膠樹(shù)紅根病在橡膠園的演變及防治對(duì)策[J]. 植物保護(hù)，1991（6）：46-48.

[10] O. Ogbebor N， T. Adekunle A， O. Eghafona N， et al. Ganoderma psuedoferreum： Biological control possibilities with microorganisms isolated from soils of rubber plantations in Nigeria[J]. African Journal of General Agriculture， 2010， 6（4）： 301-305.

[11] 項(xiàng)存悌，高克祥，何秉章，等. 楊樹(shù)爛皮病生物防治的研究[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1991（6）：15-25.

[12] 梁志懷，魏 林，陳玉榮，等. 哈茨木霉在水稻體內(nèi)的定殖及其對(duì)水稻紋枯病抗性的影響[J]. 中國(guó)生物防治，2009（2）：143-147.

[13] 李瓊芳，曾華蘭，葉鵬盛，等. 哈茨木霉（Trichoerma harzianum）T23生防菌篩選及防治中藥材根腐病的研究[J]. 西南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007（11）：119-122.

[14] 張稱英，汪祖國(guó)，衛(wèi) 勤，等. 交大木霉菌改良菌株“交大農(nóng)威”防治西瓜枯萎病示范試驗(yàn)簡(jiǎn)報(bào)[J]. 上海

農(nóng)業(yè)科技，2012（5）：116-122.

[15] Schuster André， Schmoll Monika. Biology and biotechnology of Trichoderma[J]. Appl Microbiol Biot， 2010， 87（3）： 787-799.

[16] 陳 捷，朱潔偉，張 婷，等. 木霉菌生物防治作用機(jī)理與應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2011（2）：145-151.

[17] Harman G E. Overview of Mechanisms and Uses of Trichoderma spp[J]. Phytopathology， 2006， 96（2）： 190-194.

[18] Shoresh M， Harman G E， Mastouri F. Induced systemic resistance and plant responses to fungal biocontrol agents[J]. Annu Rev Phytopathol， 2010， 48： 21-43.

[19] Harman G E. Multifunctional fungal plant symbionts： new tools to enhance plant growth and productivity[J]. New Phytol， 2011， 189（3）： 647-649.

[20] Tripathi P， Singh P C， Mishra A， et al. Trichoderma： a potential bioremediator for environmental clean up[J]. Clean Technologies and Environmental Policy， 2013， 15： 541-550.

[21] 孫興全，王秉麗，陳 捷，等. 木霉菌肥噴施桃樹(shù)效果初探[J]. 中國(guó)果樹(shù)，2012（1）：75.

[22] 張 瑾，張樹(shù)武，徐秉良，等. 長(zhǎng)枝木霉菌抑菌譜測(cè)定及其抑菌作用機(jī)理研究[J]. 中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，22（6）：661-667.

[23] 丁德娟，李世貴，唐順明，等. 木霉菌屬I(mǎi)TS PCR-RFLP及抗病多樣性差異分析[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2012（8）：146-153.

[24] 涂 敏，蔡海濱，孫愛(ài)花，等. 巴西橡膠樹(shù)紅根病菌DNA提取有效方法比較[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012（34）：12-16.

[25] 高秀兵，李增平，李曉娜，等. 橡膠樹(shù)幾種根病的人工接種方法[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2010（4）：626-630.

[26] 張運(yùn)強(qiáng)，謝藝賢，張輝強(qiáng). 橡膠樹(shù)紅根病病原菌的鑒定（Ⅱ）[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2000（1）：20-24.

[27] 熊 敏，高必達(dá)，陳 捷. 拮抗尖孢鐮刀菌的木霉菌篩選方法評(píng)估[J]. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2011（4）：498-503.