牛樟芝培養(yǎng)技術(shù)的研究進展

張知曉　季梅　澤桑梓

摘 要 牛樟芝（Antrodia camphorata）是中國臺灣特有的一種珍稀藥用真菌，具有極高的應(yīng)用和商業(yè)價值，但其生長緩慢、寄主專一性強、藥用成分不穩(wěn)定，使得大規(guī)模開發(fā)應(yīng)用牛樟芝成為難題。通過簡要介紹牛樟芝的生物學(xué)特性以及傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，重點介紹近年來各學(xué)者在牛樟芝培養(yǎng)方面，針對菌體生長和增加活性成分所進行的一些研究，使廣大學(xué)者明確牛樟芝培養(yǎng)研究的現(xiàn)狀與存在的問題，并提出在培養(yǎng)過程中添加誘導(dǎo)劑等新興技術(shù)，為廣大研究人員在快速培養(yǎng)具有原始生理活性、藥用價值高的牛樟芝方面提供一些研究思路。

關(guān)鍵詞 牛樟芝 ；人工培養(yǎng) ；生理活性

分類號 S567.3

Abstract Antrodia camphorata is an edible and medicinal fungus endemic in Taiwan and has attracted much attention to its great research and commercial values. Since it grows slowly and the component is always instability， developing and applying it widely become a problem. By introducing the biological characteristics of Antrodia camphorata， the traditional training methods， and summarizing the recently developed cultivation techniques for Antrodia camphorata， identified the research status and troubles of the research of cultivation. At last， we also put forward some new ideas such as adding revulsants and emerging technologies. The purpose of this review is to provide researchers some new research ideas， to cultivate it fast with original component.

Keywords Antrodia camphorata ； artificial cultivation ； physiological activity

牛樟芝（Antrodia camphorata或Antrodia cinnamomea）又名樟芝、牛樟菇、樟生薄孔菌等，是一種擔子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、多孔菌科、薄孔菌屬的珍稀藥用真菌[1]。牛樟芝早前就被臺灣原住居民用以治療長期飲酒造成的肝病，被譽為“藥中之王”、“森林中的紅寶石”[2]。近二十年來，臺灣及大陸的醫(yī)療界、相關(guān)機構(gòu)進行的多項研究證實牛樟芝不僅對化學(xué)性引起的肝損傷具有保護作用，能夠抑制癌細胞生長，并且具有抗氧化、抗過敏、增強免疫力、降血壓、降血脂、預(yù)防心血管疾病的功效[3]。這使得牛樟芝在醫(yī)藥行業(yè)、食品行業(yè)，甚至化妝品行業(yè)都具有極高的研究及生產(chǎn)開發(fā)價值。然而，由于適宜牛樟芝生長的牛樟樹數(shù)量稀少，牛樟芝生長速度十分緩慢，加之不法商人濫采，導(dǎo)致野生的牛樟芝資源稀缺，價格昂貴[4]。因此對其開發(fā)技術(shù)的研究應(yīng)以擴大繁殖，實現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)作為起點。

1 樟芝的生物學(xué)特性

牛樟芝野生子實體無柄，木質(zhì)或木栓質(zhì)，多有濃郁的香樟味。多呈板狀，平鋪于寄主植物表面。菌蓋表面紅褐色，厚約0.6 cm，布有密集小孔[5]。人工培養(yǎng)的子實體呈圓錐狀，直徑15～20 cm，厚20～25 cm[6]。液體發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體呈暗紅色或棕色[1]。

該菌的天然寄主牛樟樹（Cinnamomum kanehirai）僅生長于臺灣海拔450～2 000 m的山區(qū)中，屬于特有的“國寶”級保護類樹種。牛樟芝適應(yīng)幽暗、潮濕的環(huán)境，多生長于百年以上腐朽的牛樟樹樹干心材內(nèi)壁，少數(shù)生于枯死倒伏的牛樟樹木材潮濕表面。生長緩慢，生長期僅為每年的6～10月[7]。

2 牛樟芝傳統(tǒng)培育方式

由于樟芝中含有豐富的藥用成分，使樟芝的開發(fā)利用成為研究熱點。然而由于資源有限，樟芝的培育技術(shù)就成為實現(xiàn)其開發(fā)利用的一個前提技術(shù)。目前培育牛樟芝多參照傳統(tǒng)栽培食藥用菌的方法，然而由于牛樟芝生長緩慢、寄主單一、難形成子實體等特點，使得這些方法在應(yīng)用于牛樟芝的栽培中，各自都表現(xiàn)出了一定的缺陷[6]。

2.1 椴木栽培法

指利用樟芝原有宿主牛樟樹的一截椴木直接作為樟芝的培養(yǎng)基質(zhì)，用噴灑或浸泡的方法接種液體菌種后，將椴木放置于合適的溫濕度環(huán)境中，進行培養(yǎng)的一種方法。此法能夠使樟芝長出子實體，活性成分與野生樟芝最接近。但由于牛樟樹數(shù)量稀少，培養(yǎng)成本高，加上樟芝生長速度極慢，培養(yǎng)時間長達2～3年，此期間還容易被雜菌污染，質(zhì)量較難控制。由于以上原因，用椴木栽培樟芝的方法未能應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)中[8]。

2.2 固體培養(yǎng)法

通常的做法是在太空包中填充入纖維物、谷物、雜糧等培養(yǎng)料，經(jīng)滅菌后均勻地接入液體狀或顆粒狀菌種，待菌絲分散布滿培養(yǎng)料時，開口通氣培養(yǎng)，更利于菌絲深入基質(zhì)且形成子實體[9]。此法用于牛樟芝的栽培能夠?qū)⑴囵B(yǎng)時間縮短至3個月，獲得產(chǎn)物為菌絲體或與野生牛樟芝外形相似的子實體。但實驗表明無論菌絲體或子實體，其所含化學(xué)成分與野生牛樟芝均有較大差別，不能保證產(chǎn)品質(zhì)量，這可能是由于發(fā)酵基質(zhì)的成分與牛樟樹成分存在差別[10]。此外，3個月的周期仍然較長，因此固體栽培法仍難應(yīng)用于大規(guī)模的自動化生產(chǎn)中。

2.3 深層液體發(fā)酵法

通常的步驟是將營養(yǎng)物質(zhì)按一定配比制成液體狀培養(yǎng)基，裝入培養(yǎng)容器中滅菌，而后接入菌種，振蕩培養(yǎng)特定時間后獲得菌體及代謝產(chǎn)物[11]。此法是多數(shù)藥用真菌實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的必然途徑，具有周期短、成本低、質(zhì)量可控的優(yōu)點，也是目前大多科研單位對牛樟芝進行大量培育的主要方式。不足之處是發(fā)酵產(chǎn)生的牛樟芝菌絲體所含化學(xué)成分與子實體有較大區(qū)別，尤其藥用成分三萜類化合物的種類和數(shù)量都較子實體大量減少，藥用價值較低[12]。

3 改善牛樟芝培養(yǎng)的新研究

綜合以上培養(yǎng)方式的特點，如何建立適用于牛樟芝的一套培養(yǎng)方法，在較短時間內(nèi)快速培養(yǎng)具有原始生理活性、藥用價值較高的牛樟芝菌體成為廣大科研人員研究的重點。近年來，有許多關(guān)于改善培養(yǎng)方式、加速菌體生長、促進菌體分泌有用物質(zhì)的成果相繼被報道，為了便于以后廣大學(xué)者的研究，現(xiàn)將近年來的相關(guān)研究進行了總結(jié)。

3.1 加速菌體生長的研究

野生樟芝自然生長速度緩慢，而無論在實際生產(chǎn)還是科學(xué)研究時，研究人員都希望能夠快速獲得大量菌絲體。基于此目的，田雪梅等[13]研究了溫度對平板培養(yǎng)下牛樟芝菌絲體生長速度、生長勢等性狀的影響，發(fā)現(xiàn)28～32℃是最適宜菌絲體生長的溫度范圍，日均生長量長達0.384 cm。姚秀英[14]探究了固體培養(yǎng)基營養(yǎng)成分對樟芝菌絲體干重的影響。結(jié)果表明，以4∶7的比例將大米和水制成培養(yǎng)基，并且不添加其他營養(yǎng)物質(zhì)時，菌絲體干重增長迅速，在55 d時達到12.89 g。張寶榮[15]以菌體量作為目標產(chǎn)物，通過單因素實驗對搖瓶培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，確定以葡萄糖為碳源，大豆水解液和玉米漿為氮源，添加硫酸鎂和磷酸氫二鈉為最佳培養(yǎng)基，以溫度28℃、搖床轉(zhuǎn)速120 r/min、pH 5.5為最佳培養(yǎng)條件。此外，許正宏等[16]還發(fā)明了一種針對樟芝的液體快速發(fā)酵工藝，主要是通過將第一次發(fā)酵產(chǎn)生的無性孢子接種至發(fā)酵罐，進行第二次發(fā)酵，這一方法可將發(fā)酵的周期較分批發(fā)酵工藝縮短40%。

3.2 促進子實體形成的研究

樟芝子實體所含化學(xué)成分與菌絲體有較大區(qū)別，且多為重要的藥用成分，因此促進樟芝子實體快速、大量形成，能夠有效獲得極具價值的藥用成分，對此許多研究人員展開了研究。黃阿賢等[17]發(fā)明了一種牛樟芝椴木栽培法，使用的寄主材料為生長于福建省的小葉紅心樟，與傳統(tǒng)方法不同之處在于菌體培養(yǎng)過程中，添加了由蒲公英提取物、虎杖提取物、黃連提取物、陳茵提取物、荷葉提取物及蛋白胨和水組成的添加劑，使得本方法能夠獲得與野生子實體外觀、氣味、成分相同的牛樟芝子實體，但培養(yǎng)期在150～180 d。臺灣甘泉生物科技有限公司[18]也通過反復(fù)試驗，發(fā)明了一種能使牛樟芝長出子實體的固體培養(yǎng)基，其成分除常用的馬鈴薯葡萄糖抽出物、葡萄糖及瓊脂外，還特別添加了由山藥、陳皮、當歸、柴胡和檳榔等多種成分組成的中藥混合物，使用該培養(yǎng)基配合合適的培養(yǎng)方法，培養(yǎng)120～150 d，培育出的子實體與野生子實體具有相同的藥用成分。為縮短培養(yǎng)周期，陳永得等[19]對馬鈴薯培養(yǎng)基進行改良，添加用紅曲霉發(fā)酵大米后的營養(yǎng)物，混合發(fā)酵小麥、麩皮浸出液等，制成新的馬鈴薯培養(yǎng)基。用此培養(yǎng)基對牛樟芝進行培養(yǎng)，能在50～70 d后收獲黃白色菌膜和紅色的子實體。

3.3 促進有用成分合成的研究

野生牛樟芝之所以對人體具有多樣的生理活性作用，是由于其本身含有多種有藥用價值的化學(xué)成分。開發(fā)樟芝，主要目的還是應(yīng)用其中的有效成分，因此這些成分也被作為評價其培育方式科學(xué)與否的一個指標。而直接調(diào)控菌體代謝，使其在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量有用成分，也成為生產(chǎn)應(yīng)用牛樟芝的一個有效途徑。

3.3.1 三萜類化合物

三萜類物質(zhì)是牛樟芝主要的一種化學(xué)成分，是指由數(shù)個除去羥基的異戊二烯首尾相連而成的物質(zhì)，多含30個碳原子。牛樟芝中的三萜類化合物主要以麥角甾烷和羊毛甾烷為骨架。藥理學(xué)研究表明，這類物質(zhì)具有很好的保肝護肝功效，并且能抑制癌細胞的生長，起到降血壓、抗炎癥的作用，而三萜類化合物的種類越多，越有醫(yī)療價值。從目前的研究結(jié)果得知，每種靈芝內(nèi)的三萜類化合物種類約有20～50種，各種靈芝總計已發(fā)現(xiàn)三萜類化合物近200多種，而僅僅一種牛樟芝中就含有200多種的三萜類化合物。不僅在三萜類化合物的種類上樟芝比靈芝豐富，在含量上，樟芝中三萜類成分也是靈芝的10～15倍之多[20]。

Lu等[21]用兩種方法（響應(yīng)面分析和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)），以三萜類化合物為目標產(chǎn)物，對牛樟芝液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基成分進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基的碳源為葡萄糖，氮源為蛋白胨和黃豆粉時，獲得的三萜類物質(zhì)的量最多，種類也最豐富。Ma等[22]于2014年測試了多種柑橘屬植物果皮的提取物促進牛樟芝液體深層發(fā)酵產(chǎn)生三萜類化合物的效果，發(fā)現(xiàn)其盡管對菌絲生長起到抑制作用，但能夠促進酚類和三萜類化合物的生成，其中以橘子皮效果最佳，發(fā)酵28 d時能使三萜類化合物含量較對照增加10倍。陸震明[23]比較了經(jīng)石油醚和乙酸乙酯提取香樟樹枝和樹葉后的不同提取物對樟芝液體深層發(fā)酵產(chǎn)三萜類物質(zhì)的促進作用，發(fā)現(xiàn)香樟樹枝石油醚效果最佳，三萜含量較對照組增加了30.78%。而石油醚提取物中的α-松油醇是促進樟芝萜類化合物合成的主要物質(zhì)。

3.3.2 多糖

樟芝多糖（β-D-葡聚糖類）是一類雜多糖，其組成單體主要是葡萄糖、甘露糖、木糖、半乳糖等。樟芝多糖對人體主要起到活化細胞、抑制病毒、提高免疫力的作用，對保護肝臟，促進肝細胞再生也有一定效果[24]。

Lin等[25]于2006年對樟芝液體發(fā)酵生成表多糖的培養(yǎng)條件及營養(yǎng)成分進行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表多糖生成的最佳培養(yǎng)條件為溫度28℃，pH 5.5，時間14 d，額外添加葡萄糖、硝酸鈣、硫酸亞鐵和煙酸（添加量分別為5%，0.5%，0.1%和0.1%時）能夠產(chǎn)生最大量的表多糖，含量高達0.49 g/L。此外，一些其他研究還明確了樟芝發(fā)酵產(chǎn)多糖的最佳溶氧濃度為15%～20%，裝液量為120 mL，搖瓶轉(zhuǎn)速為150 r/min，接種量為15%。

3.3.3 Antroquinonol

中文名稱為安卓奎諾爾，是一類萃取自牛樟芝的泛醌類單一小分子物質(zhì)。已被證實是全球目前唯一無毒副作用的抗癌分子，主要通過抑制RAS這一控制基因轉(zhuǎn)錄激酶，進而調(diào)節(jié)細胞的增生與分化，這類物質(zhì)與腫瘤細胞的生存、增值、遷移、擴散均有關(guān)系[26]。

喻學(xué)淳等[27]于2013年探究了樟芝固態(tài)發(fā)酵過程中谷物種類、裝料量、含水量、外加碳氮源等對產(chǎn)生Antroquinonol的影響。結(jié)果表明，選擇大米作為發(fā)酵物，1 L三角瓶裝料110 g，初始含水量為50%，外加2.0 g 葡萄糖為碳源、0.3 g 大豆粉為氮源是最佳營養(yǎng)條件，發(fā)酵后Antroquinonol 產(chǎn)量最高，為696.83 mg/kg。

3.3.4 其他物質(zhì)

牛樟芝中還有豐富的抗氧化物質(zhì)，以高活性的超氧化物歧化酶（SOD）為主，這是一種能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，變成對生物體無害的分子氧與過氧化氫。利用這種高抗氧化機能來清除人體內(nèi)自由基，可有效抑制活性氧群對人體造成的病變，延緩衰老。另外樟芝中含有的多酚類、d-生育醇、抗壞血酸、D-胡蘿卜素等也是良好的天然抗氧化物質(zhì)，均具有很強的抗氧化能力。除了上述物質(zhì)，牛樟芝發(fā)酵的菌絲體中還發(fā)現(xiàn)Hepasim這一類環(huán)酰亞胺化合物，對肝炎和肝硬化有很強的改善作用；腺苷、核酸類物質(zhì)有助于改善人體血液循環(huán)系統(tǒng)；其他的氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、微量元素等物質(zhì)還能夠為人體成長提供必要的營養(yǎng)[28]。

目前，對于培養(yǎng)樟芝發(fā)酵這些物質(zhì)的報道還較少，雖然這些物質(zhì)的作用沒有前幾種重要，但仍可能是樟芝具有特殊藥理活性的原因，應(yīng)引起廣大學(xué)者足夠的重視。

3.4 新穎方法的發(fā)明研究

目前，較為廣泛應(yīng)用的培養(yǎng)牛樟芝的方法與傳統(tǒng)的食藥用真菌培養(yǎng)的方法相似，而針對牛樟芝生長緩慢等特點對培養(yǎng)裝置或過程等進行改造，能夠更有效地獲得目的產(chǎn)物。

顏宏愷等[29]設(shè)計了一種新的培養(yǎng)牛樟芝方法，將營養(yǎng)物溶于水加瓊脂制成柱狀培養(yǎng)基，取代傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法。該培養(yǎng)基制成的柱形體深達2～20 min，內(nèi)部還設(shè)置多個預(yù)定接種位，這些接種位距離培養(yǎng)基外表面0.5～10 min深，將菌種接種在這些位點，使菌絲受到培養(yǎng)基全面的包裹，多個接種位均勻分布，有利于提高柱體培養(yǎng)基營養(yǎng)成分及空間的利用率。這項設(shè)計不僅能夠提高單位培養(yǎng)基牛樟芝的生長量，而且還能有效降低雜菌的污染。

許贛榮等[30]等設(shè)計了一種表面培養(yǎng)反應(yīng)器，該反應(yīng)器為空心管狀，將谷物制成的培養(yǎng)基牢固吸附在反應(yīng)器內(nèi)壁，以模擬樟芝天然的生長環(huán)境，在培養(yǎng)基表面上接種牛樟芝進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中定時通過流加培養(yǎng)基的方式，補充菌體生長所需營養(yǎng)。該方法提高了樟芝培養(yǎng)物的生產(chǎn)率，并能夠獲得與野生樟芝形狀更為相似的培養(yǎng)樟芝。

另外，楊毅[31]發(fā)明了一種新型食藥用菌固體發(fā)酵菌粉的制作方法，即將桑黃或靈芝的子實體磨成粉狀，加水制成培養(yǎng)基，直接接以牛樟芝菌種進行發(fā)酵，得到新型的牛樟芝固體發(fā)酵菌粉。該菌粉直接可制成膠囊、口服液等產(chǎn)品，與其他復(fù)合配方的食藥用菌相比，省去了培養(yǎng)基培養(yǎng)及后期萃取等流程，具有操作工藝簡單，產(chǎn)品成分天然安全等優(yōu)點，且具有多種食藥用真菌的全部有效成分。

4 展望

牛樟芝因其野生寄主資源稀缺、培養(yǎng)環(huán)境難以模擬以及自身生長緩慢、不易形成子實體等特性，導(dǎo)致難以對其進行大規(guī)模的開發(fā)利用。近年來，關(guān)于樟芝培養(yǎng)方式及培養(yǎng)技術(shù)研究大體可歸納為兩類：第一，對傳統(tǒng)的培養(yǎng)基組成進行改造，主要指碳源、氮源和微量元素的優(yōu)化。其中前二者為微生物生長提供營養(yǎng)物質(zhì)[32]。微量元素在菌體培養(yǎng)時雖然用量很少，卻在參與細胞和酶的構(gòu)成、調(diào)節(jié)滲透壓、維持細胞膜穩(wěn)定性等方面起到重要而不可忽視的作用[33]；第二，優(yōu)化培養(yǎng)條件如溫度、濕度、光照、溶氧量和pH值等，設(shè)計經(jīng)濟有效仿原生境的培養(yǎng)裝置和培養(yǎng)技術(shù)，如表面培養(yǎng)反應(yīng)器等。這些研究進展探明了微生物發(fā)酵過程中的許多重要的影響因素，具有很大的指導(dǎo)意義。

然而，牛樟芝培養(yǎng)的研究還只處于起步階段，真正要將牛樟芝應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)還存在許多問題。例如現(xiàn)階段的研究多以單一物質(zhì)為評價指標，而綜合開發(fā)其多種藥用價值才是真正的目的。微生物培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分通過參與酶的構(gòu)成，作為酶的活化劑來調(diào)節(jié)細胞物質(zhì)代謝過程[33]，而培養(yǎng)條件中的許多因素也通過影響菌體胞內(nèi)或胞外酶的活性，進而影響細胞的生理生化過程[34]。因此不同的培養(yǎng)底物和培養(yǎng)條件，菌株發(fā)酵產(chǎn)生的次級代謝物不同。目前仍缺乏一種理想的培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件促使其大量產(chǎn)生多種有用成分，而這對于開發(fā)牛樟芝的藥用價值是非常重要的。另外，目前報道的成果都是在實驗室條件下進行，而真正要實現(xiàn)牛樟芝的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)應(yīng)用，必須將其投入到工廠化生產(chǎn)中。工廠發(fā)酵微生物與實驗室相比，存在培養(yǎng)規(guī)模大、培養(yǎng)條件不易控制、易污染雜菌等特點，而這些都可能導(dǎo)致發(fā)酵結(jié)果與實驗室內(nèi)發(fā)酵的結(jié)果存在一定差異[35]。因此，實現(xiàn)牛樟芝的大規(guī)模培養(yǎng)還有許多問題等待解決。

基于樟芝培養(yǎng)研究的現(xiàn)狀，今后的研究還有以下幾個方向值得進行嘗試：第一，添加合適的誘導(dǎo)劑可能是一個有效的策略。一些脂肪酸類和植物激素類是培養(yǎng)食藥用菌常用的誘導(dǎo)劑[36]。其中脂肪酸類物質(zhì)被報道有促進細胞的防御應(yīng)答，起信號傳遞的作用，能夠誘導(dǎo)抗逆性，誘導(dǎo)次級代謝產(chǎn)物的合成[37]。植物激素類物質(zhì)能夠激活菌體胞外酶活性，增加其對培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用[38]，還可通過加速細胞成熟來促進菌絲體的生長發(fā)育[39]；第二，許多新興技術(shù)的誕生也為牛樟芝的培養(yǎng)提供了許多可能。例如紫外線誘變技術(shù)，能夠引起生物體內(nèi)遺傳物質(zhì)發(fā)生突變，進而改變生物的生長與代謝活動，這項技術(shù)已被用于金針菇、羊肚菌等食用菌的栽培中，證實的確能夠促進菌絲體的生長[40]。磁處理技術(shù)用于其他食藥用菌的栽培，證實提高了菌體中漆酶、多酚氧化物酶等酶的活性，甚至產(chǎn)生新的酶，加速菌體對纖維素、淀粉、木質(zhì)素等養(yǎng)分的分解，加速了菌體生長，進而達到增產(chǎn)目的[41]。此外，利用不同光質(zhì)處理，能夠引起菌體內(nèi)多個基因的上調(diào)和下調(diào)，調(diào)節(jié)內(nèi)源激素的水平和分布，進而引起生長發(fā)育和形態(tài)的建成[42]，使食用菌達到增產(chǎn)的效果。由于牛樟芝的研究還處于起步階段，以上誘導(dǎo)劑及新興技術(shù)的運用還未見報道。此外，培養(yǎng)過程中的一些其他因素如菌種、接種量和有害副產(chǎn)物對菌種的生產(chǎn)發(fā)酵也可能起到很大影響，而對這些方面的研究也還很少。總之，科研工作者在牛樟芝的培養(yǎng)方面還有很大的研究空間，真正實現(xiàn)其開發(fā)應(yīng)用還需要我們不懈的努力。

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