川續(xù)斷不同炮制品中總皂苷及川續(xù)斷皂苷Ⅵ、Ⅹ含量測定

彭 丹，楊小林，黃文哲，王振中，肖 偉，楊中林*

(1.中國藥科大學 天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，江蘇 南京 210009；2.南京中醫(yī)藥大學 江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發(fā)重點實驗室，江蘇 南京 210023；3.江蘇省康緣藥業(yè)有限公司，江蘇 連云港 222002)

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川續(xù)斷不同炮制品中總皂苷及川續(xù)斷皂苷Ⅵ、Ⅹ含量測定

彭 丹1，楊小林2，黃文哲3，王振中3，肖 偉3，楊中林1*

(1.中國藥科大學 天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，江蘇 南京 210009；2.南京中醫(yī)藥大學 江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發(fā)重點實驗室，江蘇 南京 210023；3.江蘇省康緣藥業(yè)有限公司，江蘇 連云港 222002)

目的：考察川續(xù)斷不同炮制品中總皂苷及川續(xù)斷皂苷Ⅵ、Ⅹ含量的變化。方法：川續(xù)斷不同炮制品分為川續(xù)斷生品、鹽制品及酒制品，利用紫外分光光度法測定各炮制品中總皂苷的含量，高效液相色譜法測定各炮制品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ、Ⅹ的含量。結(jié)果：與續(xù)斷生品比較，酒制品和鹽制品中總皂苷含量有所下降；鹽制品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量顯著增加、川續(xù)斷皂苷Ⅹ含量顯著降低；酒制品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量顯著增加、川續(xù)斷皂苷Ⅹ含量略有降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論：川續(xù)斷不同炮制品中總皂苷及川續(xù)斷皂苷Ⅵ、Ⅹ的含量明顯不同，為川續(xù)斷不同炮制品質(zhì)量標準制訂提供參考。

川續(xù)斷；炮制品；總皂苷；川續(xù)斷皂苷Ⅵ；川續(xù)斷皂苷Ⅹ；含量測定

續(xù)斷為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷DipsacusasperWall.ex Henry的干燥根，性苦、辛，微溫，歸肝、腎經(jīng)，具有補肝腎、強筋骨、續(xù)折傷、止崩漏的作用[1]。川續(xù)斷含有三萜皂苷類、環(huán)烯醚萜、生物堿、多糖、揮發(fā)油等化學成分[2]。皂苷類是續(xù)斷的主要有效成分，不同地區(qū)含量在2.20%～19.91%之間[3]，具有抗氧化[4]、治療骨質(zhì)疏松[5]等藥理活性。續(xù)斷的炮制方法多樣，古代炮制方法包括凈制、切制、炒制、酒制等，現(xiàn)代炮制方法有酒拌后麩炒、鹽拌后麩炒、鹽制及制炭等[6]?！吨袊幍洹?010年版收載了兩種續(xù)斷的炮制方法，即酒制和鹽制，以川續(xù)斷皂苷Ⅵ作為續(xù)斷質(zhì)量控制的指標性成分。目前尚無同時評價不同炮制方法對川續(xù)斷總皂苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ、Ⅹ含量影響的報道。本實驗擬以川續(xù)斷總皂苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ、Ⅹ為評價指標，探討續(xù)斷不同炮制方法對川續(xù)斷總皂苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ、Ⅹ含量的影響。

1 材料與儀器

1.1 材料

川續(xù)斷(產(chǎn)地四川，購自亳州市瑞草中藥飲片有限責任公司，經(jīng)中國藥科大學中醫(yī)藥教研室楊中林教授鑒定為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷DipsacusasperWall.ex Henry的干燥根)；川續(xù)斷皂苷Ⅵ、Ⅹ(均為本實驗室自制，川續(xù)斷皂苷Ⅵ的純度為98.0%，川續(xù)斷皂苷Ⅹ的純度為94.9%)；齊墩果酸對照品(購自中國食品藥品檢定研究院，批號：110709-201206，純度為94.9%)；黃酒(旦陽牌丹陽黃酒，江蘇省丹陽酒廠)；食鹽(江蘇省鹽業(yè)集團有限公司)；純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)；乙腈(色譜純，美國天地有限公司)； 香蘭素(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；高氯酸(分析純，金鹿化工有限公司)；冰醋酸(分析純，江蘇強盛功能化學股份有限公司)。

1.2 儀器

BS124S型萬分之一電子天平(德國賽多利斯集團)；TB-25型十萬分之一電子天平(北京丹佛儀器有限公司)；B-260型恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)；KQ-250E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；752N紫外分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)；Agilent 1260型高效液相色譜系統(tǒng)(美國安捷倫公司)，DAD型檢測器。

2 方法與結(jié)果

2.1 川續(xù)斷不同炮制品制備

2.1.1 鹽制[1]取適量川續(xù)斷生品，加鹽水拌勻，悶置過夜，置炒制容器內(nèi)，以文火加熱，炒至表面黑褐色、味微咸時，取出，放涼，常溫下密封保存，備用。鹽制時，每100kg待炮制品用食鹽2kg。

2.1.2 酒制[1]取適量川續(xù)斷生品，加黃酒拌勻，悶透，置炒制容器內(nèi)，用文火炒至表面淺黑色或灰褐色、略有酒香氣時，取出，放涼，常溫下密封保存，備用。酒制時，每100kg待炮制品用黃酒10～20kg。

2.2 川續(xù)斷總皂苷含量測定

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取齊墩果酸對照品3.30mg，加甲醇定容至25mL，得0.132mg/mL的標準品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取續(xù)斷生品粉末0.5g，用20mL 70%乙醇回流提取3次，每次提取時間為1h。將3次提取液合并后濾紙常壓過濾，減壓濃縮去掉乙醇，濃縮液再加蒸餾水定容至25mL。用石油醚(沸程60～90℃)萃取藥材提取濃縮液3次，每次15mL。萃取后水層80℃水浴蒸干，加甲醇溶解定容至50mL。

2.2.3 顯色反應 取一定量齊墩果酸對照品溶液或供試品溶液置具塞試管中，80℃水浴揮干溶劑后，精密加入0.2mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8mL高氯酸，密塞搖勻，60℃恒溫水浴加熱15min，取出立即冰水浴5min，加入5mL冰醋酸，搖勻。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL齊墩果酸對照品溶液。0mL設為空白對照組，各組按“2.2.3”項下顯色反應顯色后，以554nm為測定波長，對照品濃度(C)為橫坐標，吸光度值(A)為縱坐標，繪制標準曲線，進行回歸分析，得回歸方程為Y=48.924X+0.024 2，r=0.999 7。結(jié)果表明，川續(xù)斷總皂苷含量在0.81～20.6μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度考察 精密吸取0.5mL齊墩果酸對照品溶液，共5份，按“2.2.3”項下顯色反應后，于554nm波長下測定吸光度。川續(xù)斷總皂苷吸光度RSD值為0.35%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液50μL，共5份，按“2.2.3”項下顯色反應后，分別于0、0.5、1、2、4h測定吸光度。川續(xù)斷總皂苷吸光度RSD值為1.96%，表明供試品溶液在4h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復性試驗 精密稱取適量續(xù)斷生品細粉，均勻分成5份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，各吸取供試品溶液50μL，按“2.2.3”項下顯色反應后，于554nm波長下測定吸光度。川續(xù)斷總皂苷吸光度RSD值為1.03%，表明該方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取6份已知含量的續(xù)斷生品粉末，分別精密加入齊墩果酸對照品溶液，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，各吸取供試品溶液50μL，按“2.2.3”項下顯色反應后，于554nm波長下測定吸光度,計算川續(xù)斷總皂苷加樣回收率。川續(xù)斷總皂苷加樣回收率分別為104.7%、99.5%、103.1%、100.5%、104.2%，RSD值為2.21%。

2.2.9 樣品含量測定 分別精密稱取0.5g不同炮制品粉末，各取3份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，各吸取供試品溶液50μL，按“2.2.3”項下顯色反應后，于554nm波長下測定吸光度。計算得生品續(xù)斷、酒續(xù)斷、鹽續(xù)斷中川續(xù)斷總皂苷的含量，結(jié)果見表1。

2.3 川續(xù)斷皂苷Ⅵ、Ⅹ含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Boston Green ODS-AQ (4.6mm×250mm，5μm)，流動相為乙腈-水(30∶70)，流速為1.0mL/min，檢測波長為212nm，進樣量為20μL，柱溫為30℃。在此色譜條件下，川續(xù)斷皂苷Ⅵ、Ⅹ與其相鄰組分達到完全分離，分離度大于1.5，峰形對稱，兩種成分的理論塔板數(shù)均不低于5 000，見圖1。

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱定川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品6.90mg和川續(xù)斷皂苷Ⅹ對照品5.25mg，分別加甲醇定容至5mL，制成川續(xù)斷皂苷Ⅵ、Ⅹ 各自濃度為1.38、1.05mg/mL的溶液，搖勻，0.45μm有機濾膜過濾，得對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液制備[1]取續(xù)斷飲片細粉約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率100W，頻率40kHz)30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液2mL，置5mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

圖1 川續(xù)斷混合對照品及不同炮制品HPLC圖譜

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3.2”項下對照品溶液，稀釋成川續(xù)斷皂苷Ⅵ質(zhì)量濃度分別為1.38、1.46、0.732、0.366、0.183、0.092mg/mL，川續(xù)斷皂苷Ⅹ質(zhì)量濃度分別為1.05、0.840、0.420、0.210、0.105、0.053mg/mL。按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，以對照品進樣濃度(X)為橫坐標，峰面積積分值(Y)為縱坐標，進行線性回歸分析。川續(xù)斷皂苷Ⅵ線性回歸方程為Y=2 823.1X-50.047，r=0.999 9，川續(xù)斷皂苷Ⅹ線性回歸方程為Y=1 451.5X-11.203，r=0.999 6。結(jié)果表明，川續(xù)斷皂苷Ⅵ在1.83～0.095mg/mL范圍內(nèi)，川續(xù)斷皂苷Ⅹ在1.05～0.056mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度考察 精密吸取同一供試品溶液20μL，按“2.3.1”項下色譜條件重復進樣5次。川續(xù)斷皂苷Ⅵ、X峰面積的RSD值分別為0.85%、0.57%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件分別于0、2、4、6、12h精密吸取20μL進樣分析。川續(xù)斷皂苷Ⅵ、Ⅹ峰面積的RSD值分別為1.30%、0.46%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復性試驗 精密稱取一定量續(xù)斷飲片細粉，均勻分成5份，分別按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件測定。川續(xù)斷皂苷Ⅵ、Ⅹ濃度的RSD值分別為2.05%、1.24%，表明此方法重復性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 精密稱取5份已知含量的續(xù)斷生品細粉，分別精密加入適量川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品和川續(xù)斷皂苷Ⅹ對照品，按“2.3.3 ”項下方法制備供試品溶液，按“3.3.1”項下色譜條件測定，計算川續(xù)斷皂苷Ⅵ和川續(xù)斷皂苷Ⅹ各自的加樣回收率。川續(xù)斷皂苷Ⅵ加樣回收率分別為98.2%、102.3%、98.2%、96.3%、101.7%，RSD值為2.57%。川續(xù)斷皂苷Ⅹ加樣回收率分別為101.1%、103.1%、103.5%、97.0%、103.6%，RSD值為2.76%。

2.3.9 樣品含量測定 分別精密稱取約0.5g不同炮制品粉末，每種炮制品各3份，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進行測定，計算得生品續(xù)斷、酒續(xù)斷、鹽續(xù)斷中川續(xù)斷皂苷Ⅵ、Ⅹ的含量，結(jié)果見表2。

2.4 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果分析

3.1 川續(xù)斷不同炮制品中總皂苷含量

與川續(xù)斷生品相比，川續(xù)斷酒制品和鹽制品中總皂苷含量均有明顯下降，且川續(xù)斷酒制品的總皂苷含量最低，僅為7.98%。詳見表1。

3.2 川續(xù)斷不同炮制品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ、Ⅹ含量

與川續(xù)斷生品比較，川續(xù)斷酒制品和鹽制品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ、Ⅹ含量均有不同程度變化。川續(xù)斷鹽制品的川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量最高，較川續(xù)斷生品增加36.13%，達到4.71%，而川續(xù)斷皂苷Ⅹ含量則下降67.13%，僅為0.904%，兩者總含量顯著下降。川續(xù)斷酒制品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量增加7.51%，川續(xù)斷皂苷Ⅹ含量下降3.6%，兩者總含量略有上升。詳見表2。

表1 川續(xù)斷不同炮制品中總皂苷含量 (n=3)

注：與生品含量比較，▲P<0.05；▲▲P<0.01。

表2 川續(xù)斷不同炮制品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ、Ⅹ含量 (n=3)

注：與生品含量比較，▲P<0.05；▲▲P<0.01。

4 討論

川續(xù)斷皂苷類是川續(xù)斷的主要有效成分。川續(xù)斷皂苷Ⅵ已作為《中國藥典》2010年版續(xù)斷不同炮制品的指標性成分。川續(xù)斷皂苷Ⅹ是川續(xù)斷中含量較高的皂苷類成分之一，但尚未納入《中國藥典》作為川續(xù)斷質(zhì)量控制的指標性成分?，F(xiàn)代研究表明中藥化學成分復雜多樣，不同炮制品的化學成分及藥理作用具有很大差異，僅用一種化學成分作為不同炮制品的質(zhì)量控制指標性成分難以反映中藥的質(zhì)量。

酒制續(xù)斷可用于溫腎強筋骨，活血化瘀，抗炎鎮(zhèn)痛。鹽制續(xù)斷則使其藥效下行，強于補肝腎，主治腰膝酸軟和消血腫[1,7]。通過對續(xù)斷生品的不同炮制處理，滿足了續(xù)斷的臨床使用需要。本實驗結(jié)果顯示，川續(xù)斷生品總皂苷含量最高，其酒制品和鹽制品的總皂苷含量均有不同程度降低。與川續(xù)斷生品比較，川續(xù)斷鹽制品的川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量最高，川續(xù)斷皂苷Ⅹ含量最低。川續(xù)斷酒制品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量顯著升高、但不及鹽制品。川續(xù)斷皂苷Ⅹ含量略有下降，但顯著高于鹽制品。川續(xù)斷酒制品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ和川續(xù)斷皂苷Ⅹ總含量位于不同炮制品之首。

綜上所述，不同炮制方法對川續(xù)斷中總皂苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ、Ⅹ含量影響顯著，且各有不同，揭示了續(xù)斷不同炮制品物質(zhì)基礎發(fā)生了不同的變化，為川續(xù)斷不同炮制品質(zhì)量標準制訂提供了實驗參考。川續(xù)斷酒制品和鹽制品藥理作用的不同是否與川續(xù)斷不同炮制品中總皂苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ、Ⅹ含量的變化有關(guān)，還有待進一步研究。

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[3] 劉永,衛(wèi)瑩芳,閆婕,等.不同產(chǎn)地續(xù)斷中總皂苷的含量測定[J].時珍國醫(yī)國藥,2009，20(11):2767-2768.

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(責任編輯：魏 曉)

Quantitative Determination of Total Saponins and Asperosaponin VI,X in the Different Processed Products ofDipsacusAsper

Peng Dan1,Yang Xiaolin2,Huang Wenzhe3,Wang Zhenzhong3,Xiao Wei3,Yang Zhonglin1*

(1.China Pharmaceutical University，State Key Laboratory of Natural Medicines,Nanjing 210009,China;2.Nanjing University Of Chinese Medicine,Key Laboratory of Research and Development of Marine Medicinal Material Resources in Jiangsu Province,Nanjing 210023;3.JiangSu Kanion Pharmaceutical co.ltd.，Lianyungang 222002,China)

Objective:To investigate the content changes of total saponins and asperosaponin VI、X in the different prepared products of Dipsacus asper.Methods:The different prepared products of Dipsacus asper was divided into raw products,salt products and wine products.The experiment adopted UV spectrophotometric to quantitatively analyze of total saponins in the different processed products,and determined the content of asperosaponin VI、X by High Performance Liquid Chromatography.Results:Comparing with in raw product of Dipsacus asper,the content of total saponins remarkably decreased in wine products and salt products; Asperosaponin VI significantly increased,and asperosaponin X evidently decreased in salt products; Asperosaponin VI significantly increased,and tasperosaponin X decreased slightly (P<0.05 orP<0.01)) in wine products.Conclusion:The content of total saponins and asperosaponin VI、X is markedly different in the different processed products of Dipsacus asper,that provided a reference for the quality standard of different processed products of Dipsacus asper.

DipsacusAsper；Processed Products；Total Saponins；Asperosaponin VI；Asperosaponin X；Content Determination

2015-02-25

彭丹(1992-),男，中國藥科大學碩士研究生，研究方向為中藥制劑。

楊中林(1950-)，女，中國藥科大學教授，研究方向為中藥制劑。E-mail：yzl1950@126.com

R284

A

1673-2197(2015)13-0034-04

10.11954/ytctyy.201513014