當(dāng)歸多糖對血管型癡呆低糖低氧PC12細胞凋亡的影響

鄧健男，曾靜玲，李海龍，楊植媛，楊長生

(1.武漢市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 武漢430100；2.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730000)

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當(dāng)歸多糖對血管型癡呆低糖低氧PC12細胞凋亡的影響

鄧健男1，曾靜玲1，李海龍2，楊植媛2，楊長生2

(1.武漢市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 武漢430100；2.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730000)

目的：觀察當(dāng)歸多糖 (Angelica Sinensis Polysaccharide ride，ASP ) 對低亞硫酸鈉誘導(dǎo)的低糖低氧PC12細胞模型的影響，探討當(dāng)歸多糖影響細胞凋亡的作用機制。方法：將體外培養(yǎng)的大鼠腎上腺嗜鉻腫瘤細胞(PCl2細胞)分為空白對照組、OGD(oxygen-glucose deprivation)模型組、當(dāng)歸多糖組，采用MTT法檢測各組細胞存活率，采用比色法檢測LDH、T-SOD、MDA酶學(xué)指標(biāo)，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，采用RT-PCR檢測Bax和Bcl-2表達情況。結(jié)果：缺糖缺氧損傷組細胞存活率均顯著低于空白對照組(P<0.05)，各劑量當(dāng)歸多糖組細胞存活率均高于損傷組，且200μg·L-1濃度的當(dāng)歸多糖組細胞存活率最高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：當(dāng)歸多糖可提高LDH、T-SOD活性，降低MDA含量，有效降低細胞凋亡率，可不同程度地保護PC12細胞。

當(dāng)歸多糖；血管型癡呆；細胞凋亡

細胞缺糖缺氧(Oxygen-Glucosedeprivation，OGD)損傷多見于腦缺血、心肌缺血等缺血性損傷疾病。ODG是血管性癡呆(Vascular dementia，VD)的典型癥狀，其發(fā)生發(fā)展與神經(jīng)細胞所處的OGD環(huán)境有密切關(guān)系。壞死和凋亡是缺血性神經(jīng)細胞損傷的兩種主要形式。當(dāng)歸作為中醫(yī)圣藥，含有阿魏酸、藁本內(nèi)酯、當(dāng)歸多糖等多種成分，對免疫系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、血液系統(tǒng)等均有一定的藥理作用[1-2]。筆者選擇當(dāng)歸多糖進行研究，嘗試從酶學(xué)角度揭開當(dāng)歸治療VD的機制。

1 材料與儀器

PC-12細胞(上海中科院生物研究所)；LDH、T-SOD、MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20110928)；新生小牛血清(Gibco公司)；DMEM培養(yǎng)基(Sigma公司，批號：20120430)；低亞硫酸鈉(天津精細化工有限公司，批號：20120405)；Benchmark plus連續(xù)波長酶標(biāo)儀(上海新振儀器設(shè)備有限公司)；倒置顯微鏡(日本奧林巴斯光學(xué)株式會社，型號：IX71)；COULTER EPICS XL流式細胞儀(美國beckman公司)；CFX-96實時反應(yīng)系統(tǒng)(美國博樂公司)。

2 方法

2.1 VD細胞模型制備和分組

參考石瑞麗等[3-4]方法稍加改進建立OGD模型，在CO2培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)中，采用含15%新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)PC12細胞，2～3天傳代1次，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。將正常DMEM培養(yǎng)液(含15%的新生小牛血清)培養(yǎng)的PC12細胞作為正常對照組；在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中，將各組缺糖缺氧1、4、12h的PC12細胞模型組分別用含20mmol·L-1與40mmol·L-1低亞硫酸鈉的無糖PBS液培養(yǎng)相應(yīng)時間后作為模型組，測定相關(guān)指標(biāo)。

2.2 四氮唑藍比色法(MTT法)檢測細胞活力

采用 MTT 法檢測造模后PC12細胞的活力變化，待PC12細胞生長至對數(shù)生長期時，采用DMEM培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)至3×105個·mL-1。將上述各組細胞懸液分別以100μL/孔的計量滴入96孔培養(yǎng)板，設(shè)置正常細胞對照孔和調(diào)零孔，向調(diào)零孔中加入100μL DMEM完全培養(yǎng)基，向?qū)φ战M孔中加入100μL細胞懸液。實驗處理后各組每孔加入MTT 10μL，37℃孵育4h后移棄培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在570nm波長下，采用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔光吸收值(OD值)，記錄結(jié)果。

2.3 生化法檢測細胞培養(yǎng)上清液LDH、MDA和SOD含量

經(jīng)損傷處理后，收集細胞上清液，參照試劑盒說明書，采用比色法于紫外可見分光光度計上檢測上清液中LDH、MDA和SOD活性。

2.4 流式細胞術(shù)檢測凋亡情況

采用Annexin V-FITC和PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，調(diào)整細胞計數(shù)為1×106個·mL-1，接種于T-50培養(yǎng)瓶中，參照試劑盒說明書進行檢測，記錄激發(fā)光波長為475nm處的熒光強度。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 細胞活力檢測

采用MTT法檢測細胞活力發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，40mmol·L-1低亞硫酸鈉1h模型組細胞存活率顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但隨著時間的延長，細胞存活率又有所回升，可能與造模劑的逐漸消耗有關(guān)；與模型組比較，各給藥組細胞存活率均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 當(dāng)歸多糖對不同濃度低亞硫酸鈉造模各組細胞存活率的影響 ±s,n=6)

注：與對照組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05。

3.2 酶學(xué)指標(biāo)檢測

與模型組比較，各組細胞溶液MDA含量均顯著降低，T-SOD酶、LDH酶活性顯著增強，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與空白對照組比較，40mmol·L-1低亞硫酸鈉模型組細胞MDA含量顯著升高，T-SOD酶、LDH酶活性顯著下降，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。不同濃度的當(dāng)歸多糖作用于PC12細胞后，與模型組比較，200μg·L-1當(dāng)歸多糖組細胞MDA含量顯著降低，T-SOD酶、LDH酶活性顯著增強，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

3.3 細胞凋亡率檢測

各劑量當(dāng)歸多糖組細胞存活率均高于損傷組，且200μg·L-1濃度當(dāng)歸多糖組細胞存活率最高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

組別LDH活力(U·mL-1)T-SOD活力(U·mL-1)MDA含量(nmol·mL-1)空白組68.39±5.131.45±0.073.31±0.4340mmol·L-1低亞硫酸鈉組46.43±4.13*1.24±0.06*7.10±0.27*25μg·L-1組48.72±4.47#1.30±0.06#6.06±0.31#50μg·L-1組52.49±5.12#1.32±0.05#4.60±0.44#100μg·L-1組56.81±4.47#1.34±0.06#3.63±0.56#200μg·L-1組56.76±7.23#1.32±0.04#4.35±0.41#

注：與對照組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05。

圖1 各濃度當(dāng)歸多糖對細胞凋亡率影響

3.4 RT-PCR檢測Bax和Bcl-2的表達情況

隨著劑量的增加，當(dāng)歸多糖給藥組細胞Bax表達量逐漸降低，Bcl-2表達量逐漸升高，與空白組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

組別BaxBcl-2空白組0.85±0.031.05±0.0640mmol·L-1低亞硫酸鈉造模組1.00±0.001.00±0.0025μg·L-1當(dāng)歸多糖組1.52±0.06△1.54±0.13△50μg·L-1當(dāng)歸多糖組1.39±0.05△2.16±0.23△100μg·L-1當(dāng)歸多糖組1.02±0.03△3.29±0.34△200μg·L-1當(dāng)歸多糖組0.93±0.02△7.07±0.47△

注：與空白組比較，△P<0.05。

4 討論

腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡類型包括壞死、凋亡和自噬三種[5]，由于凋亡和自噬延遲發(fā)生，使其成為藥物治療的靶點，但自噬在其中的作用還存在爭議[6]?？姶好鞯萚7]通過對PC12細胞OGD損傷過程的研究發(fā)現(xiàn)，自噬和凋亡在細胞OGD損傷過程的早期和晚期分別占有主導(dǎo)地位。凋亡蛋白表達引起細胞死亡，凋亡造成的神經(jīng)細胞大量丟失可能是VD發(fā)生的原因[8]。Bcl-2家族基因的表達和調(diào)控對細胞的凋亡有著至關(guān)重要的作用，其可通過多種通路參與細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Bax和Bcl-2是Bcl-2家族中最有代表性的促進凋亡和抑制凋亡的基因，其中Bax作為Bcl-2活性的主要調(diào)控因子，參與細胞凋亡進程[9]。

采用一定濃度的連二亞硫酸鈉與培養(yǎng)液中的低濃度O2反應(yīng)模擬缺氧環(huán)境，通過無糖PBS緩沖液模擬缺糖環(huán)境，可有效避免頻繁開合培養(yǎng)箱導(dǎo)致的造模環(huán)境不穩(wěn)的弊端，更方便有效地模擬ODG模型[3-4]。

最新研究表明，當(dāng)歸提取物以及當(dāng)歸組成的復(fù)方補陽還五湯對血管性癡呆患者的行為學(xué)和海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)等有較好的改善作用。大量文獻提示當(dāng)歸相關(guān)制劑對心血管疾病患者血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞等組織的Bax和Bcl-2表達有明顯調(diào)節(jié)作用，提示當(dāng)歸有效成分對血管性癡呆具有潛在的治療作用[10-13]。本研究結(jié)果表明當(dāng)歸多糖能顯著提高體外培養(yǎng)PC12的T-SOD、LDH的生物活性，降低MDA含量，降低細胞凋亡率，這也表明當(dāng)歸多糖能有效提高PC12的抗凋亡能力，可能與其調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax的表達有關(guān)。

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(責(zé)任編輯：尹晨茹)

2015-03-09

鄧健男(1987-)，男，湖北省武漢市中醫(yī)醫(yī)院藥師，研究方向為方劑學(xué)。

R285.5

A

1673-2197(2015)13-0007-03

10.11954/ytctyy.201513003