桑螵蛸炮制前后蛋白質(zhì)和多糖及脂類成分比較

賈坤靜，艾 雪，賈天柱，2*，鞠成國,2

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600； 2.遼寧省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116600)

?

桑螵蛸炮制前后蛋白質(zhì)和多糖及脂類成分比較

賈坤靜1，艾 雪1，賈天柱1，2*，鞠成國1,2

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600； 2.遼寧省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116600)

目的：比較桑螵蛸炮制前后蛋白質(zhì)提取率及多糖和脂類的含量差異。方法：采用考馬斯亮藍(lán)法測定桑螵蛸生制品蛋白質(zhì)提取率，硫酸苯酚法和減重法分別測定桑螵蛸生制品中多糖和總脂的含量，抗壞血酸-鉬藍(lán)光度法測定磷脂的含量，并進(jìn)行分析對(duì)比。結(jié)果：蛋白質(zhì)提取率和多糖含量均為生品>鹽炒品>蒸品，總脂含量為蒸品>鹽炒品>生品，磷脂含量生品>蒸品>鹽炒品。結(jié)論：桑螵蛸經(jīng)過鹽炒和蒸制后，蛋白質(zhì)提取率以及多糖和磷脂含量均下降，總脂含量升高。

桑螵蛸；蛋白質(zhì)；多糖；脂類

桑螵蛸是一味傳統(tǒng)中藥，有著悠久的藥用歷史。其味甘、咸、平，歸肝、腎經(jīng)，具有固精縮尿、補(bǔ)腎助陽的功效[1]。查閱中外文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)，關(guān)于桑螵蛸炮制前后的化學(xué)成分比較未見報(bào)道。炮制對(duì)中藥的化學(xué)成分有重要影響，而炮制前后化學(xué)成分的變化必然引起中藥藥效的變化。有關(guān)桑螵蛸的蛋白類成分，國內(nèi)研究較少。桑螵蛸的主要成分為蛋白質(zhì)，約占桑螵蛸重量的58.5%[2]。桑螵蛸蛋白質(zhì)中含有18種氨基酸，其中有8種是人體必需氨基酸[3]?，F(xiàn)代研究已證實(shí)，多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、降血糖、抗凝血、抗血栓等作用[4]。磷脂是構(gòu)成神經(jīng)組織, 特別是腦脊髓的主要成分; 同時(shí)也是構(gòu)成血球及其它細(xì)胞膜的重要物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)桑螵蛸炮制前后蛋白質(zhì)和多糖以及脂類成分進(jìn)行了比較，以期找出桑螵蛸炮制前后的成分差異，為桑螵蛸的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材

桑螵蛸，采自大連莊河。經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)王冰教授鑒定為“團(tuán)螵蛸”(螳螂科昆蟲大刀螂Tenodera sinensis Saussure的干燥卵鞘)。

蒸桑螵蛸：取桑螵蛸置于蒸鍋中，加適量清水蒸至“圓氣”后繼續(xù)用文火蒸10min，取出，晾干，即得。

鹽炒桑螵蛸：每100g桑螵蛸藥材用30mL鹽水(含2.5g鹽)悶潤1h，在100℃下文火炒10min，取出放涼，即得[2]。

1.2 試劑

小牛血清(純度>98%,由sigma公司提供)； 無水葡萄糖(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)：20130910)；考馬斯亮藍(lán)G-250；磷酸；石油醚；95%乙醇；活性炭；氯仿；正丁醇；苯酚；濃硫酸；磷酸二氫鉀；鉬酸銨；濃硝酸；抗壞血酸；過氧化氫；冰醋酸；酚酞；所用試劑均為分析醇，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.3 儀器

電磁爐，RE-52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；B-220恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-D(III)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；DFT-200手提式高速萬能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；Alpha4冷凍干燥機(jī)(Christ北京思達(dá)興業(yè)儀器有限公司)；離心機(jī)；T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；HZ-A6002電子天平(瑞安市金訊貿(mào)易有限公司)；METTLER AE240型十萬分之一分析天平(瑞士METTLER)；FA1004B型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；pH 計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；Multiskan-MK3型酶標(biāo)儀(賽默飛世爾儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白提取率

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取牛血清蛋白凍干粉10mg,加入適量水溶解，于10 mL容量瓶定容，得到濃度為1.031 mg/mL的對(duì)照品溶液。分別精密吸取牛血清蛋白對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于試管中，加水稀釋至1mL。另取一試管加入1mL水作為空白對(duì)照管，各試管中加入考馬斯亮藍(lán)G-250顯色劑4.0mL，混勻，室溫下顯色30min，于595nm處測定吸光度，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得回歸方程y=0.4184x+0.1688(r=0.999)。

2.1.2 Tris-cl緩沖液配制 稱量60.5g Tris置于燒杯中，加入約400mL水，充分?jǐn)嚢枞芙?，加入濃HCl調(diào)節(jié)pH=9，作為提取蛋白的緩沖液。

2.1.3 脫脂 取桑螵蛸生品、鹽炒品和蒸品粉碎，過60目篩。稱取桑螵蛸生制品粉末，以固液比1∶8(g/mL)加入石油醚，超聲提取3次，每次30min，過濾，脫脂粉末干燥備用。

2.1.4 蛋白提取 精確稱取生品、鹽炒品、蒸品脫脂粉，每份5g。根據(jù)前期單因素試驗(yàn)優(yōu)選條件，以固液比1∶15加入pH=9的Tris-cl緩沖液，在40℃的條件下提取18h，5 000r離心15min，取上清液，于595nm處測吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。

2.1.5 結(jié)果 相同提取條件下的生品，鹽炒品和蒸品的蛋白提取率均降低，桑螵蛸生制品蛋白提取率均值見表1。

表1 桑螵蛸生品蛋白提取率 (n=6)

2.2 硫酸苯酚法測定多糖含量

2.2.1 多糖的提取 稱取“2.1.3”項(xiàng)所得桑螵蛸生制品脫脂粉各20g，加入10倍量的水回流煎煮1.5h，濾過，藥渣再重復(fù)回流提取2次，合并3次所得濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮至30mL，加入160mL 95%乙醇，使混合后溶液的乙醇濃度達(dá)到80%。攪拌均勻之后放入4℃冰箱中一夜。第二天可見白色沉淀析出，3000r/min離心10min，棄去上清液，收集沉淀得粗多糖。

2.2.2 活性炭除色素 將粗多糖溶于純水中，加入活性炭粉末攪拌后抽濾，反復(fù)幾次，直到濾液變得澄清無色。

2.2.3 Sevage法除蛋白 將氯仿和正丁醇以5∶1的比例混合，將除去色素后的溶液倒入分液漏斗中，加入氯仿和正丁醇混合液，劇烈搖晃后靜置分層，在水相和有機(jī)相的交界面可看到變性的蛋白質(zhì)析出，棄去有機(jī)層和蛋白質(zhì)層。如此反復(fù)多次，直到無蛋白層出現(xiàn)。

2.2.4 供試品溶液制備 將除去蛋白的粗多糖溶液于25mL容量瓶定容待測。

2.2.5 對(duì)照品溶液制備 取105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖對(duì)照品，精密稱定，加水溶解并于10mL容量瓶中稀釋定容，配制成每1mL含葡萄糖1.081mg的對(duì)照品溶液。

2.2.6 選擇測定波長 分別精密吸取對(duì)照品溶液和粗多糖溶液各1mL于試管中，加入1mL苯酚溶液和濃硫酸5mL，放入沸水浴中加熱15min，取出冷卻至室溫，于200～800nm區(qū)間掃描，對(duì)照品與供試品均在490nm處有最大吸收峰，因此選擇490nm為測定波長。

2.2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于干凈試管中，補(bǔ)加水至1.0mL。然后分別加入1.0mL 5%的苯酚，再緩慢加入5.0mL濃硫酸,輕輕搖晃使其混合均勻。另取一只試管，加入1.0mL純水，1.0mL 5%的苯酚和5.0mL濃硫酸作為空白對(duì)照，搖勻。置沸水浴中加熱15min，取出冷卻至室溫，于490nm處測定吸光度值，以吸光度為縱坐標(biāo)，糖濃度為橫坐標(biāo)，得到回歸方程：y=0.5225x+1.8703，r=0.999。

2.2.8 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液1.0 mL，按“2.2.7”項(xiàng)方法測定6次，計(jì)算得RSD=1.13%，表明精密度良好。

2.2.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 稱取桑螵蛸生品粉末6份，按“2.2.1”項(xiàng)和“2.2.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液并測定吸光度，得多糖平均含量為1.59%，RSD=1.35%。

2.2.10 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取桑螵蛸生品供試液，按“2.1.7”項(xiàng)方法測定吸光度，每5min測定1次，共測定6次。RSD=2.07%，表明桑螵蛸中多糖在30min內(nèi)顯色情況基本穩(wěn)定。

2.2.11 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的生品粉末6份，每份1g。按“2.2.1”項(xiàng)和“2.1.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液，各加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品15.6mg，并按照“2.1.7”項(xiàng)方法測定吸光度，計(jì)算得多糖回收率為99.30%，RSD=2.33%。

2.2.12 結(jié)果 稱取桑螵蛸生品、鹽炒品、蒸品粉末按“2.2.1”項(xiàng)和“2.2.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液并測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，得總多糖平均含量，見表2。

表2 桑螵蛸生制品多糖含量 (n=6)

2.3 減重法測定總脂含量

桑螵蛸生品、鹽炒品和蒸品粉碎，過60目篩。稱取生制品粉末各20g,以石油醚作為提取溶劑，固液比1∶8回流2h后過濾。共回流提取3次，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，減重法得總脂。桑螵蛸經(jīng)炮制后總脂的含量均明顯升高，平均含量如表3所示。

表3 桑螵蛸生制品總脂含量 (n=6)

2.4 抗壞血酸-鉬藍(lán)光度法測定磷脂含量

采用抗壞血酸-鉬藍(lán)光度法，用混酸濕法消化油樣, 然后以硫酸調(diào)節(jié)反應(yīng)酸度，加入鉬酸銨溶液并以抗壞血酸作為還原劑，75℃水浴反應(yīng)20min后在820nm處測定吸光度，計(jì)算磷脂含量[5]。

2.4.1 磷標(biāo)準(zhǔn)使用液配制 取105℃干燥至恒重的無水磷酸二氫鉀，精密稱定，加水溶解并于100mL容量瓶中稀釋定容，配制成每1mL 含磷0.1mg的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 按文獻(xiàn)[5]測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的條件和步驟測定出的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=28.325x+0.0038(y為磷濃度，x為吸光度，r=0.999)。

2.4.3 樣品消化及磷脂含量測定 稱取“2.3”項(xiàng)所得桑螵蛸生品、鹽炒品和蒸品油樣各1.0g，按照文獻(xiàn)[5]的方法進(jìn)行消化并測吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得桑螵蛸生制品磷脂的含量。桑螵蛸經(jīng)過炮制后磷脂含量較生品均有所下降，磷脂平均含量見表4。

表4 桑螵蛸生制品磷脂含量 (n=6)

3 討論

桑螵蛸富含蛋白質(zhì)，對(duì)治療遺尿具有顯著療效。從中藥成分與藥效的相關(guān)性來看，桑螵蛸的藥理作用很有可能與其所含的蛋白質(zhì)有關(guān)。緩沖液法提取蛋白質(zhì)簡單易行，且提取效率較高，因此作者采用Tris-cl緩沖液作為提取試劑，來比較桑螵蛸生制品的蛋白提取率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 桑螵蛸經(jīng)加熱炮制后蛋白提取率較生品有所下降，這與蛋白加熱后變性，在緩沖液中溶解度減小有關(guān)。

多糖作為一種生物活性物質(zhì), 在很多方面發(fā)揮著不可替代的作用, 在醫(yī)學(xué)方面應(yīng)用也越來越廣泛。近年來，隨著分子生物學(xué)的興起和發(fā)展, 多糖在生命過程中所起的重要作用也被越來越深入地發(fā)現(xiàn)和挖掘出來。研究表明，桑螵蛸對(duì)免疫器官有增強(qiáng)作用[ 6 ]，能提高機(jī)體的免疫機(jī)能。桑螵蛸鹽炒品和蒸品的多糖含量均低于生品，說明鹽炒和蒸制會(huì)導(dǎo)致桑螵蛸多糖含量降低。

桑螵蛸經(jīng)炮制后，鹽炒品和蒸品的總脂含量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于生品，這是由于高溫可以破壞細(xì)胞,有利于脂類從細(xì)胞中出來。此外，脂蛋白在昆蟲體內(nèi)普遍存在，高溫可使蛋白質(zhì)變性，脂類聚集，降低了黏度和表面張力，更利于脂類的釋放。

磷脂具有重要的生理意義, 它是細(xì)胞中脂肪酸新陳代謝的中間產(chǎn)物，是構(gòu)成細(xì)胞生物膜脂雙層的基本骨架，也是構(gòu)成各種脂蛋白的主要組成成分，大腦和神經(jīng)細(xì)胞的組成中磷脂必不可少。磷脂能調(diào)節(jié)人體代謝、消除大腦疲勞、提高人體記憶力、防止動(dòng)脈粥樣硬化。桑螵蛸中磷脂含量豐富, 有磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇及溶血磷脂酰膽堿等[7]?？箟难?鉬藍(lán)分光光度法顯色快速, 操作簡便,不需要特殊試劑，且顏色穩(wěn)定,是一種快速、安全、準(zhǔn)確測定磷含量的方法[8]。本實(shí)驗(yàn)采用抗壞血酸-鉬藍(lán)分光光度法測定桑螵蛸生制品中的磷脂含量，結(jié)果穩(wěn)定可靠。磷脂不耐熱，在高溫條件下極不穩(wěn)定，易發(fā)生分解。桑螵蛸經(jīng)過鹽炒和蒸制的高溫后，磷脂含量下降，鹽炒品和蒸品均較生品低。

查閱歷年關(guān)于桑螵蛸的文獻(xiàn), 其化學(xué)成分方面多集中在粗成分的研究，關(guān)于生品及炮制品的對(duì)比研究則是少之又少。中藥炮制對(duì)于中藥的化學(xué)成分和藥理作用有顯著影響。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和人們對(duì)藥物研究認(rèn)識(shí)的深入，對(duì)桑螵蛸炮制前后化學(xué)成分和藥理作用的進(jìn)一步研究可以為臨床用藥提供參考，具有重要意義和廣闊的發(fā)展前景。

[1] 國家藥典委員會(huì).中國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2010:281-282.

[2] 張保國,張大祿.動(dòng)物藥[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2003: 523-529.

[3] 楊會(huì)全,程地蕓,葉玉蘭.3種桑螵蛸的氨基酸含量分析[J].基層中藥雜志,1999,13(3):16-17.

[4] 吳笳笛.多糖的作用及其研究進(jìn)展[J].沈陽師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2008(2):221-223.

[5] 萬楚筠,黃鳳洪,李文林.抗壞血酸-鉬藍(lán)光度法測定油脂中磷脂含量的研究[J].中國油脂,2006(4):46-49.

[6] 譚正懷,雷玉蘭,張白嘉,等.桑縹峭的藥理比較研究[J].中國中藥雜志,1997，22(8):496.

[7] 許益明,王永珍.桑螵蛸磷脂及游離氨基酸成分分析[J].中藥材,1989,12(8):24-25.

[8] 黃城,周燕,曾淦寧,等.抗壞血酸-鉬藍(lán)分光光度法測定海藻中磷的研究探討[J].海洋環(huán)境學(xué),2009(1):76-78.

(責(zé)任編輯：余 婷)

Comparision of Protein and Polysaccharide and Lipids in Antis Egg-case before and after Processing

Jia Kunjing1,Ai Xue1,Jia Tianzhu1,2*,Ju Chengguo1,2

(1.Pharmacy College，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, China; 2.Chinese Materia Medica Processing Engineering Center of Liaoning Province, Dalian 116600, China)

Objective:Compare polysaccharide and lipids in antis egg-case before and after processing.Methods:Use phenol sulfuric acid method and weight loss method to determine the content of polysaccharide and total fat in antis egg-case before and after processing,and ascorbic acid-molybdenum blue method for determining the content of phosphatide.Results:The content of protein and polysaccharide from high what is the non-processde sample ,the salt-fride sample and the water-steamde sample. The content of total fat from high what is the water-steamde sample,the salt-fride sample and the non-processde sample.The content of phosphatide from high what is the non-processde sample,the water-steamde sample,the salt-fride sample.Conclusion:The content of polysaccharide and phosphatide are declined after processing,and the content of total fat is rised.

Antis Egg-case;Protein;Polysaccharide;Lipids

2015-07-15

國家中醫(yī)藥管理局行業(yè)專項(xiàng)(201107007)

賈坤靜(1989-)，女，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幣谥圃怼?/p>

賈天柱(1951-)，男，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教授、博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幣谥圃怼?/p>

R284.1

A

1673-2197(2015)23-0015-03

10.11954/ytctyy.201523007