附子干姜與辛伐他汀及其聯(lián)用治療馬兜鈴酸腎病研究

陳燕喬，張雅倩，王友群

(中國藥科大學 藥理研究室，江蘇 南京 210009)

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附子干姜與辛伐他汀及其聯(lián)用治療馬兜鈴酸腎病研究

陳燕喬，張雅倩，王友群*

(中國藥科大學 藥理研究室，江蘇 南京 210009)

目的：觀察附子干姜、辛伐他汀及聯(lián)用對關(guān)木通所致馬兜鈴酸腎病模型的影響。方法：將雄性ICR小鼠隨機分為5組：正常組(C)、模型組(M)、附子干姜組(FG)、辛伐他汀組(X)、附子干姜+辛伐他汀組(FGX)；模型組及各治療組小鼠灌胃給予關(guān)木通水煎劑(7g/kg·d)，正常組小鼠灌胃給予等量水，給藥4天后停藥3天，持續(xù)4周；各治療組自第3周起分別給予附子干姜(5g/kg·d)、辛伐他汀(10mg/kg·d)、附子干姜(5g/kg·d)+辛伐他汀(10mg/kg·d)。4周后取小鼠血清測定肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平，取腎組織測定丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GT)濃度，并記錄左腎、左睪丸系數(shù)。結(jié)果：與模型組比較，各治療組均可降低血清肌酐、尿素氮、尿酸、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶水平，且兩者合用可增加附子干姜對肌酐、尿酸的排泄；與模型組比較，各給藥組均能升高腎組織中γ-GT含量，且FG組與FGX能升高腎組織MDA水平，降低GSH水平。結(jié)論：附子干姜與辛伐他汀對馬兜鈴酸腎病均有保護作用，且兩者聯(lián)用可相互補充，提高治療馬兜鈴酸腎病的效應。

馬兜鈴酸腎??；腎臟纖維化；附子干姜；辛伐他汀

馬兜鈴酸(Aristolochic acids，AAs)為馬兜鈴科植物的主要次生代謝物，對機體可產(chǎn)生較強的腎毒性、致癌性和致突變作用，其中馬兜鈴酸Ⅰ(AAⅠ)和馬兜鈴酸Ⅱ(AAⅡ)為其主要毒性有效成分[1]。慢性馬兜鈴酸腎病多由長期持續(xù)或間斷性小劑量服用含馬兜鈴酸中草藥所導致的腎間質(zhì)纖維化疾病。研究發(fā)現(xiàn)，馬兜鈴酸可通過多種病理機制誘導腎近曲小管上皮細胞凋亡[2]，但目前仍缺乏有效的治療方法，因此利用動物模型進行相關(guān)研究是有必要的。

關(guān)木通性味苦寒，在機體內(nèi)阻礙氣化，造成陽虛陰盛，形成以寡細胞性腎間質(zhì)纖維化為主要的病理特征[3]，與慢性馬兜鈴酸腎病患者的臨床表現(xiàn)相似。附子具有回陽救逆、溫陽利水、散寒止痛的功效，現(xiàn)代藥理學研究證實附子有改善微循環(huán)、抗寒冷和興奮垂體—腎上腺皮質(zhì)激素等作用[4]，常與干姜配伍使用，可達增效減毒的作用。辛伐他汀為常見降血脂藥物，研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物除降脂的腎臟保護作用外，還有非依賴降脂的腎臟保護作用，其作用機制包括抑制藥物在近端腎小管細胞的聚集、產(chǎn)生抗脂質(zhì)過氧化、減少蛋白尿，下調(diào)血管緊張素受體、改善血管內(nèi)皮細胞功能，從而延緩腎臟損害[5]。本研究目的為探討附子干姜、辛伐他汀及聯(lián)合應用對慢性馬兜鈴酸腎病模型小鼠的治療作用及機理。

1 材料

1.1 藥品與試劑

關(guān)木通飲片購自南京市百信藥房，黑附子購自于南京市益豐大藥房；干姜購自于南京市先聲藥店，所用中藥材均經(jīng)專家鑒定確認；辛伐他汀(批號：140327，海南海靈化學制藥有限公司)購自南京先聲大藥房。肌酐、尿素氮、尿酸、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、丙二醛、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽等試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 動物與儀器

雄性清潔級小鼠90只，體重為(25±2)g，購自南京青龍山動物繁殖廠，動物合格證號：SCXK(蘇)2007-0001。實驗期間給予標準飼料，自由攝食飲水，室內(nèi)溫度控制為20～25℃。

721分光光度計(上海第三分析儀器廠)；0412-1型低速離心機(上海醫(yī)療器械有限手術(shù)器械廠)；BS-110-S型電子天平(北京賽多利斯公司)。

2 方法

2.1 中藥水煎劑制備

稱取適量關(guān)木通，加入8倍體積自來水，浸泡1h，武火煮沸后微沸1h，4層紗布過濾，收集濾液；殘渣加入6倍體積的自來水，微沸30min，亦過濾；合并兩次濾液，文火濃縮，得相當于0.7g/mL關(guān)木通的水煎液。同法制備附子干姜水煎劑0.5g/mL。

2.2 實驗方法

經(jīng)環(huán)境適應性飼養(yǎng)1周后，將雄性ICR小鼠隨機分為5組：正常對照組(C組)、關(guān)木通模型組(M組)、附子干姜組(FG組)、辛伐他汀組(X組)、附子干姜+辛伐他汀組(FGX組)。C組給予灌胃等體積飲用水，其他4組灌胃給予7g/kg·d的關(guān)木通水煎劑，給藥4天后停藥3天，持續(xù)4周；從第3周起，各給藥組在給予造模藥基礎(chǔ)上再分別灌胃給予相應的治療藥物，即FG(5g/kg·d)、X(10mg/kg·d)、FG(5g/kg·d)+X(10mg/kg·d)。

2.3 指標測定

各組小鼠給藥4周后，摘除眼球取血并處死解剖，血樣旋轉(zhuǎn)離心(1 500r·min-1，10 min)后取上層血清于-20℃下保存，用于測定血清SCr、BUN、ALT、AST、UA等指標。取左側(cè)肝臟和腎臟的部分組織按1∶9質(zhì)量體積比加入生理鹽水，在冰浴條件下制成10%的組織勻漿，以2 000rpm的轉(zhuǎn)速，離心10min后取上清液于-20℃保存?zhèn)錅y。SCr、BUN、ALT、AST、γ-GT、蛋白、MDA、GSH等指標測定的具體操作按試劑盒說明書進行。

2.4 統(tǒng)計學分析

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠左腎系數(shù)、左睪丸系數(shù)變化

與正常組比較，模型組小鼠左腎系數(shù)顯著升高(P<0.01)，左睪丸系數(shù)顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，各治療組左腎系數(shù)均有顯著性降低(P<0.01)，左睪丸系數(shù)顯著升高(P<0.01)，且在降低腎系數(shù)方面附子干姜組效應最為顯著。見表1。

表1 各組小鼠左腎系數(shù)、左睪系數(shù)測定結(jié)果 ±s，n=8)

注：與C組比較，*P<0.05，**P<0.01；與M組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.2 各組小鼠血清生化指標變化

與正常對照組比較，模型組小鼠肌酐、尿素氮、尿酸和谷草、谷丙的含量均顯著升高(P<0.01)；與模型組相比較，F(xiàn)G組、X組、FGX組生化指標的含量均顯著降低(P<0.01)，且辛伐他汀組血清肌酐、尿酸濃度與正常組比較無明顯差異。見表2。

表2 各組小鼠血清生化指標測定結(jié)果比較 ±s，n=8)

注：與C組比較，*P<0.05,**P<0.01;與M組比較,#P<0.05，##P<0.01。

3.3 各組小鼠腎臟生化指標變化

與正常組比較，模型組小鼠腎臟組織中MDA、γ-GT、GSH均顯著性升高(P<0.01)；附子干姜組和附子干姜+辛伐他汀組均能顯著性升高腎臟MDA、γ-GT的含量(P<0.01)，降低GSH含量(P<0.05)；辛伐他汀組小鼠腎臟組織中γ-GT的含量有顯著升高(P<0.01)，對MDA、GSH含量的影響與模型組無較大差別。見表3。

表3 各組小鼠腎臟生化指標測定結(jié)果比較 ±s，n=8)

注：與C組比較，*P<0.05，**P<0.01；與M組比較，#P<0.05，##P<0.01。

4 討論

中醫(yī)學認為，藥物性腎損害為藥毒侵襲臟腑，耗傷氣血，或傷及臟腑后失治、誤治，導致久病臟腑虧損、氣血陰陽虛衰、腎精虧虛，可歸于中醫(yī)學虛勞范疇[6]。腎氣虧虛、氣化不足，升清泌濁功能障礙，不能及時轉(zhuǎn)輸、運化水液及毒素，從而形成濕濁、濕熱、尿毒、瘀血等癥狀[7]。馬兜鈴酸類藥物關(guān)木通引起的腎纖維化疾病特點為起病隱匿、進展較快。目前公認的治療原則主要為延緩腎病進展。附子干姜辨證治療腎陰腎陽虧，辛伐他汀對癥治療、抗炎，促進毒性藥物及其代謝產(chǎn)物的排泄，兩者合用，以期達到標本兼治的目的。

本實驗結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠的腎臟系數(shù)顯著性增加(P<0.01)，睪丸系數(shù)顯著性降低(P<0.01)，觀察發(fā)現(xiàn)模型組小鼠的腎臟發(fā)白腫大，睪丸萎縮，顯示關(guān)木通已造成腎臟損傷，且對生殖系統(tǒng)造成一定損害。在腎功能不全時，肌酐、尿素氮、尿酸在體內(nèi)蓄積成為對機體有害的毒素，為檢查腎功能的主要指標，本實驗發(fā)現(xiàn)模型組小鼠肌酐、尿素氮及尿酸均顯著增加(P<0.01)。轉(zhuǎn)氨酶為反映肝臟功能的指標，主要存在于肝細胞內(nèi)，當肝細胞發(fā)生炎癥、壞死、中毒等造成肝細胞受損時，轉(zhuǎn)氨酶便會釋放到血液里，使血清轉(zhuǎn)氨酶升高。模型組結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ALT、AST均顯著性增加(P<0.01)，研究指出AAⅠ在體內(nèi)分布具有器官特異性，雖大部分在腎臟組織分布且清除緩慢，但部分在肝臟代謝可能造成一定程度的肝組織損傷[8]。γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GT)主要存在于血清及除肌肉外的所有組織中，其中以腎近曲小管刷狀邊緣含量最高，且血清γ-GT的含量與慢性腎病進展有關(guān)[9]。本實驗結(jié)果顯示：模型組γ-GT顯著性降低(P<0.01)，推測原因可能為腎間質(zhì)纖維化時腎小管上皮細胞可見刷狀邊緣脫落，上皮細胞濁腫，顆粒變性及壞死脫落，嚴重者有腎小管基膜裸露[10]，從而導致γ-GT含量降低。MDA、GSH則反映腎臟損傷狀態(tài)的小鼠腎臟細胞氧化還原狀態(tài)。通常腎組織氧自由基的產(chǎn)生與清除處于相對平衡狀態(tài)，但慢性腎損傷時，機體的氧化與抗氧化系統(tǒng)發(fā)生改變。實驗中模型組顯著性降低腎臟MDA(P<0.01)，GSH升高(P<0.01)，說明模型組小鼠腎臟中氧化還原相關(guān)酶處于低活性狀態(tài)，推測可能與馬兜鈴酸腎病引起的腎陽虛證候有關(guān)，且γ-GT為參與谷胱甘肽及其衍生物代謝的關(guān)鍵酶[11]，其含量降低會導致GSH的蓄積。

與模型組相比較，在腎系數(shù)與睪丸系數(shù)方面，附子干姜組、辛伐他汀組及合用組均能顯著性降低腎系數(shù)(P<0.01)，升高睪丸系數(shù)(P<0.01)，且附子干姜腎臟保護作用最強，兩者合用較辛伐他汀組有較好的降低腎系數(shù)作用。推測原因可能為附子干姜配伍使用充分發(fā)揮其溫陽通脈作用；他汀類則主要通過抑制藥物的聚集，產(chǎn)生抗炎等效應[12]，合用可增強辛伐他汀腎臟保護效應。在肌酐、尿素氮與尿酸方面，治療組能顯著降低血清中的濃度(P<0.01)，且辛伐他汀組促進肌酐、尿酸排泄能力最強，附子干姜降低尿素氮能力最強，兩者合用可提高附子干姜對肌酐與尿酸的排泄。研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物能作用于腎近端小管細胞的SLCO4C1轉(zhuǎn)運體，促進代謝產(chǎn)物和毒素的排泄[13]。附子干姜可發(fā)揮其通經(jīng)活絡、上通下達、行走于表里的作用。在谷草轉(zhuǎn)氨酶與谷丙轉(zhuǎn)氨酶方面，治療組均有顯著的保護作用(P<0.01)。在MDA、GSH與γ-GT含量方面，附子干姜組能顯著性升高MDA與γ-GT含量(P<0.01)，降低GSH含量(P<0.05)；而辛伐他汀組對MDA、GSH作用不明顯，能顯著性升高γ-GT含量(P<0.01)；兩則合用可改善附子干姜對γ-GT的作用，而對MDA、GSH的作用略有降低，無顯著性差異。

在慢性腎病治療中，常選用類固醇類激素和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶進行治療，但通常會產(chǎn)生較多的不良反應且療效并不顯著，因此研發(fā)新型藥物已成為治療慢性腎臟纖維化疾病的主要方向。本實驗選用炮制附子干姜治療關(guān)木通所致的馬兜鈴酸腎病，發(fā)揮其溫脾、腎之陽、助氣化而行水濕的功效，兩藥配伍，相須并用?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，附子干姜能發(fā)揮抗炎、降低蛋白尿及恢復腎功能的作用[14]，辛伐他汀可通過影響基質(zhì)金屬蛋白酶家族及抑制轉(zhuǎn)化生長因子β表達等作用，延緩腎臟纖維化。本實驗還研究兩者合用對腎病的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：兩者合用能提高附子干姜對毒素的排泄，升高腎臟組織γ-GT的含量，提示附子干姜與辛伐他汀合用在延緩腎纖維化疾病方面可發(fā)揮各自的優(yōu)勢，起到協(xié)同作用，可控制腎臟纖維化發(fā)展，但其具體作用機制還需進一步探討。

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(責任編輯：李嵐春)

Effective Treatment of Aconite and Dried Ginger，Simvastatin and Combination on Renal Interstitial Fibrosis Induced by Aristolochic Acid

Chen Yaoqiao,Zhang Yaqian,Wang Youqun*

(Department of Pharmacology,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China)

Objective:To explore the influence of aconite and dried ginger，simvastatin and their combination on renal interstitial fibrosis induced by aristolochic acid. Methods:Male ICR mice were randomly divided into 5 groups including control(C) group，model(M) group，aconite and dried ginger(FG)group，simvastatin(X)group，aconite and dried ginger+ simvastatin(FGX)group. The mice in control group，in model group and in three treatment group were given distilled water or Caulis Aristolochiae Manshuriensis (7g/kg·d，the first four days every week and for a period of 4 weeks)，and the treatment groups were given different drugs (FG(5g/kg·d)，X(10mg/kg·d)，F(xiàn)G(5g/kg·d)+X(10mg/kg·d)since the third week by intragastric administration. At the end of the experiment，in blood serum the levels of creatine(SCr)，urea nitrogen(BUN)，uric acid(UA)，alanine transaminase(ALT) and aspartate aminotransferase(AST) were measured; in kidney tissue the contents of malondialdehyde(MDA),glutathione(GSH)，γ-Glutamyltransferase(γ-GT) were detected.Results:(1) Compared with M group,the treatment groups significantly reduced the levels of Cr，BUN，UA，ALT and AST，and when combined with simvastatin，aconite and dried ginger promoted the excretion of creatine and uric acid.(2) Compared with M group，the treatment groups improved the contents ofγ-GT，aconite and dried ginger，the combination group both increased the contents of MDA and lowered the contents of GSH. Conclusion:Aconite and dried ginger，simvastatin both exert the protection of aristolochic acid nephropathy，and when combined together，they can complement ?each other to against the renal interstitial fibrosis.

Aristolochic Acid Nephropathy;Renal Interstitial Fibrosis;Aconite and Dried Ginger; Simvastatin

2014-11-04

陳燕喬(1988-)，女，中國藥科大學藥理研究室碩士研究生，研究方向為心血管藥理。E-mail: chenyanqiao10@163.com

王友群(1956-)，男，中國藥科大學副教授，研究方向為心血管藥理學。E-mail: wyqfbox@163.com

R277.51

A

1673-2197(2015)06-0018-03

10.11954/ytctyy.201506008