基于HPLC法同時測定3個苷元含量的射干藥材質(zhì)量評價研究

姜 鴻，張婧涵，鄒桂欣，李國信*，張振秋*

(1.遼寧省中醫(yī)藥研究院, 遼寧 沈陽 110034；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院 ,遼寧 大連 116600)

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基于HPLC法同時測定3個苷元含量的射干藥材質(zhì)量評價研究

姜 鴻1，張婧涵2，鄒桂欣1，李國信1*，張振秋2*

(1.遼寧省中醫(yī)藥研究院, 遼寧 沈陽 110034；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院 ,遼寧 大連 116600)

目的：建立射干藥材中野鳶尾黃素、白射干素和次野鳶尾黃素3個苷元的含量測定方法，比較不同產(chǎn)地及不同栽培方式射干藥材中3個苷元的含量。方法：采用HPLC法，使用Phenomenex Synergi 4u Polar-RP色譜柱，流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脫，流速0.5mL/min，柱溫40℃，檢測波長為266nm。結(jié)果：野鳶尾黃素在140.2～1402μg(r=0.999 9，n=6)，白射干素在96.4～964μg(r=0.9998，n=6)，次野鳶尾黃素在77～770μg(r=0.999 9，n=6)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；平均加樣回收率分別為：99.05%、98.86%、97.52%(n=9)。結(jié)論：該方法靈敏、快速、準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)，可為射干藥材的質(zhì)量評價研究提供理論依據(jù)。

射干；野鳶尾黃素；白射干素；次野鳶尾黃素；HPLC

射干為鳶尾科植物射干(Belamcandachinensis(L)DC.)的根莖，味苦辛，性寒，歸肺、肝經(jīng)。具有清熱解毒、祛痰利咽、消癖散結(jié)之功效，臨床用于治療痰涎壅盛、咽喉腫痛、痰咳氣喘、胸脅滿悶、瘰疬、癰腫瘡毒等癥，為中醫(yī)治療喉痹咽痛之要藥。射干主要含有黃酮類和異黃酮類化合物，此外還有酮類、醌類、酚類、二環(huán)三萜類、甾類化合物等，射干中的苷元具有明顯的抗炎作用[1-3]。

1 儀器與試藥

儀器：Agilent 1100高效液相色譜儀、四元泵、DAD檢測器(Agilent公司)；電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；KQ3200超聲波清洗器(超聲功率120 W,工作頻率40kHz,昆山市超聲儀器有限公司)。

對照品：野鳶尾黃素(批號：20140609)、白射干素(批號：20140621)均購于江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司，純度均大于98.5%；次野鳶尾黃素(批號：111557-200602)購于中國食品藥品檢定研究院)。

藥材：不同產(chǎn)地的栽培和野生射干藥材，均是花期后采集，經(jīng)遼寧省中醫(yī)藥研究院藥學(xué)研究室鑒定為鳶尾科植物射干(Belamcandachinensis(L)DC.)。

試劑：甲酸、乙腈為色譜純；水為哇哈哈純凈水；乙醇為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱(Phenomenex Synergi 4u Polar-RP 250mm×4.6mm)，流動相為0.1%甲酸水溶液(A)，乙腈(B)，梯度洗脫(0～70min，86%A→86%A；70～71min，86%A→81%A；71～145min，81%A→0%A；145～155min，0%A→0%A)，流速：0.5mL/min，柱溫：40℃，檢測波長：266nm。

2.2 對照品溶液制備

(4)花崗質(zhì)片麻巖類殘坡積物：在北部許雙頭及南部滴水崖區(qū)域分布，主要出露二長花崗質(zhì)片麻巖體。淀積層一般呈酸性-中酸性，母質(zhì)風(fēng)化后一般成麻石黃棕壤，土壤質(zhì)地多為砂壤土。

精密稱取野鳶尾黃素、白射干素和次野鳶尾黃素對照品適量，加甲醇分別制成含量為0.701、0.482、0.385mg/mL的對照品儲備溶液。

2.3 供試液制備

取射干藥材根莖適量，粉碎成細(xì)粉，精密稱取1g，精密加入70%乙醇25mL，超聲提取30min，冷卻，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，混勻，用微孔濾膜，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.4 專屬性試驗

分別取上述對照品溶液、供試品溶液進(jìn)行測定，色譜見圖1。

A.對照品; B.供試品;1.野鳶尾黃素;2.白射干素;3.次野鳶尾黃素

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取野鳶尾黃素、白射干素和次野鳶尾黃素對照品儲備液逐級稀釋，分別制成一系列不同濃度的對照品混合溶液，分別進(jìn)樣，記錄峰面積，以對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明3種成分線性關(guān)系良好。詳見表1。

表1 3種指標(biāo)成分的線性關(guān)系 (n=6)

精密吸取野鳶尾黃素、白射干素和次野鳶尾黃素的對照品混合溶液(濃度分別為70.1、38.5、48.2μg/mL)，在上述色譜質(zhì)譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果野鳶尾黃素、次野鳶尾黃素和白射干素峰面積的RSD分別為1.6%、0.85%、1.2%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗

取同一批射干藥材(編號SG1) 粉末，按“2.3”項下方法制得6份供試品溶液，進(jìn)樣分析，結(jié)果野鳶尾黃素、白射干素和次野鳶尾黃素的平均含量分別為3.52mg/g、0.53mg/g、1.66mg/g，RSD分別為1.8%、1.3%、2.3%，結(jié)果表明該實驗重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣，結(jié)果野鳶尾黃素、白射干素和次野鳶尾黃素的峰面積RSD分別為2.1%、1.9%、2.5%，結(jié)果表明供試液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量的射干藥材粉末(編號SG1)，精密稱取0.5g，共9份，分別按高、中、低質(zhì)量濃度分別精密加入混合對照品溶液適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液。分別測定，計算加樣回收率，結(jié)果野鳶尾黃素、白射干素和次野鳶尾黃素的平均回收率分別為：99.05%、98.86%、97.52%，RSD分別為：0.9%、1.7%、1.9%。

2.10 樣品含量測定

分別取不同來源的射干藥材粉末，每個編號平行2份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，測定，計算平均含量，結(jié)果見表2。

表2 不同來源射干藥材的3種苷元含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法考察

根據(jù)待測組分化學(xué)性質(zhì)，曾采用50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、乙醇、甲醇等不同提取溶媒對射干進(jìn)行提取，結(jié)果70%乙醇提取所制備的供試品溶液干擾成分少，各主成分峰分離較理想，且被測各成分含量最高；曾對超聲和加熱回流提取進(jìn)行考察，結(jié)果超聲和加熱回流提取時被測定成分的含量幾乎沒有區(qū)別，而且超聲提取的供試液色譜圖雜質(zhì)干擾小；對超聲提取時間考察結(jié)果表明，超聲提取30min即可提取完全。因此，選擇70%乙醇超聲提取30min作為供試品溶液制備方法。

3.2 測定波長選擇

取野鳶尾黃素、白射干素和次野鳶尾黃素對照品溶液在200～400nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外吸收掃描，結(jié)果3個成分均在266nm下有最大吸收，且測定過程中發(fā)現(xiàn)266nm下基線平穩(wěn)，各峰峰型較好。《中國藥典》2010版射干藥材項下次野鳶尾黃素的HPLC測定波長為266nm，故本試驗選擇266nm作為測定波長。

3.3 流動相的選擇

實驗中發(fā)現(xiàn)射干中有一些成分與被測3個成分很難分離，可能是結(jié)構(gòu)和極性都比較接近。因此，本實驗選擇梯度洗脫，并考查了水與乙腈、磷酸水溶液與乙腈、甲酸溶液與乙腈不同配比，發(fā)現(xiàn)甲酸溶液與乙腈配比的分離效果較好。同時考查了不同濃度的甲酸水溶液、流速和柱溫對分離效果的影響，最后確定0.1%甲酸水溶液與乙腈配比，流速為0.5mL/min，柱溫為40℃時，峰型和分離度最好。

3.4 小結(jié)

文獻(xiàn)報道，射干中的苷元具有明顯的抗炎作用，《中國藥典》2010版射干藥材項下只對單一成分次野鳶尾黃素進(jìn)行了定量分析，本實驗建立了同時測定射干中野鳶尾黃素、白射干素和次野鳶尾黃素的高效液相色譜法，且方法靈敏度高，簡便，重復(fù)性好，為深入研究射干藥材的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供一定科學(xué)方法依據(jù)。

比較不同產(chǎn)地的射干藥材中野鳶尾黃素、白射干素和次野鳶尾黃素含量，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地射干藥材中3種苷元含量有所差異，原因可能與氣候、光照時間、海拔高度和土壤成分等生長條件有關(guān)。而且同一生長地點，栽培射干中3種苷元含量高于野生的，原因可能是栽培采集的都是3年生的射干藥材，而野生的很難控制生長年限，或者是栽培的可以人為控制生長條件，比如澆水、施肥和除雜草等對藥材生長有較大影響的因素。因此，今后有必要考察氣候、光照時間、海拔高度、土壤成分等自然因素和澆水、施肥等人為因素對射干藥材中有效成分含量的影響，以便控制和提高射干藥材的質(zhì)量。

[1] 齊建紅,李宏衛(wèi).123射干的化學(xué)成分、藥理作用及臨床應(yīng)用[J].國外醫(yī)藥·植物藥分冊,2006,21(3):111-114.

[2] 李曉蘭.中藥射干的研究概況[J]. 海峽藥學(xué),2003,15(5):72-74.

[3] 邱鷹昆,高玉白,徐碧霞,等.射干的化學(xué)成分研究[J].中國藥學(xué)雜志,2006,41(15):1133- 1135.

(責(zé)任編輯：宋勇剛)

2014-01-19

國家重大新藥臨床技術(shù)平臺資助項目(2012zx09303-017)；國家自然科學(xué)基金資助項目(81273927)

姜鴻(1975-)，男，遼寧省中醫(yī)藥研究院副研究員，研究方向為中藥新藥開發(fā)與中藥質(zhì)量控制。

李國信(1963-)，男，博士，遼寧省中醫(yī)藥研究院博士生導(dǎo)師，研究方向為中藥臨床藥理學(xué)。E-mail：syyljdlgx024@126.com；張振秋(1964-)，男，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。E-mail：zhangzhenqiu@sina.com

R284.1

A

1673-2197(2015)09-0021-03

10.11954/ytctyy.201509009