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    廢水現(xiàn)狀毒性試驗(yàn)(魚類)方法的宏觀質(zhì)量控制因素分析

    2015-04-26 00:55:50楊國(guó)強(qiáng)盧振蘭孫國(guó)志
    關(guān)鍵詞:靈敏性斑馬魚魚類

    劉 杰,楊國(guó)強(qiáng),李 成,于 力,盧振蘭,孫國(guó)志

    1.吉林省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站,吉林 長(zhǎng)春 130011

    2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),吉林 長(zhǎng)春 130000

    3.公主嶺市環(huán)境保護(hù)監(jiān)測(cè)站,吉林 公主嶺 136100

    構(gòu)成廢水生物毒性的物質(zhì)具有多樣性和不確定性,對(duì)生命機(jī)體產(chǎn)生的毒害作用也存在多種方式,或?qū)е轮舷?,或影響神?jīng)系統(tǒng)以及循環(huán)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等。致毒機(jī)理的差異要求測(cè)定技術(shù)體系具有對(duì)等的適應(yīng)性,這樣的要求給測(cè)試技術(shù)提出難題;由于毒害作用現(xiàn)象具有差異,較低等的試驗(yàn)生物可能由于沒有發(fā)育形成相應(yīng)的辨別毒性的組織系統(tǒng),識(shí)別毒性的偏激性或更為突出(如無內(nèi)分泌功能的低等試驗(yàn)生物對(duì)于內(nèi)分泌系統(tǒng)毒性物質(zhì)的識(shí)別等)。魚類是水中機(jī)體進(jìn)化發(fā)育更接近于人類的高等動(dòng)物,使用魚類作為試驗(yàn)動(dòng)物的毒性測(cè)定方法獲得了更廣泛的應(yīng)用。在淡水范圍內(nèi),魚類的種類繁雜多樣,受試魚種類的選擇、方法的試驗(yàn)形式、試驗(yàn)魚的種內(nèi)差異和來源差異以及如何使用方法內(nèi)在的線性推導(dǎo),同樣給技術(shù)體系帶來不同的影響。這些宏觀上的影響與方法技術(shù)操作的細(xì)微影響一樣,也需要進(jìn)行有效的質(zhì)量控制,才能獲得方法技術(shù)體系與待測(cè)目標(biāo)樣本間的對(duì)應(yīng)統(tǒng)一,從而保證測(cè)量結(jié)果的正確性。

    經(jīng)典的毒性測(cè)定技術(shù)主要考慮“已知毒性”如何有效應(yīng)用的篩分與度量,在保證一致性和重現(xiàn)性的基礎(chǔ)上,選定試驗(yàn)動(dòng)物(如小白鼠),利用統(tǒng)一的靈敏性尺度滿足毒性效應(yīng)間橫向?qū)Ρ确治龅暮侠硇?。環(huán)境管理中這種技術(shù)應(yīng)用的重點(diǎn)是生態(tài)系統(tǒng),毒性試驗(yàn)的目的在于能以一定準(zhǔn)確度去預(yù)報(bào)對(duì)整個(gè)系統(tǒng)無害的濃度,或稱“確定一種廢物的最高濃度”[1]作為允許濃度以保障水環(huán)境的安全。經(jīng)典方法的共同特點(diǎn)是該被測(cè)毒物一般為“已知”,且實(shí)驗(yàn)并不急于即刻獲得結(jié)果。而應(yīng)用于廢水領(lǐng)域以識(shí)別毒性的存在和預(yù)警為目標(biāo)的測(cè)試技術(shù)則與之不同,后者多屬于“未知毒性”的體系和以“毒性現(xiàn)狀”為直接測(cè)試目標(biāo)。

    隨著對(duì)危害人群健康因素的了解和環(huán)境污染控制范圍的擴(kuò)大,捕獲未知毒性存在的預(yù)警意義越來越大。為滿足這種需求,靈敏性通用尺度的確認(rèn)越來越重要,因?yàn)樗P(guān)乎到方法的檢出限。另外,出于監(jiān)管和預(yù)警的需求,其實(shí)驗(yàn)結(jié)果也應(yīng)及時(shí)產(chǎn)出,這是兩者質(zhì)的差異。此外,監(jiān)管的主要目標(biāo)是“現(xiàn)狀”,而生態(tài)影響限度的確認(rèn)需求則可能是被“稀釋后的濃度”?;诒O(jiān)管的需求,方法對(duì)毒性的檢出能力成為廢水毒性管理預(yù)警測(cè)定宏觀質(zhì)控的第一要素,更靈敏的試驗(yàn)魚種類的選擇成為方法適用性的前提。

    魚類是水中最高等級(jí)的動(dòng)物,常見的毒性測(cè)定技術(shù)多采用魚類作為試驗(yàn)生物,其原因在于魚類能夠照顧到來自更多方面的毒性刺激,捕獲面更廣。但是,單一的魚類在測(cè)定時(shí)同樣具有偏執(zhí)性,是否采用組合魚的結(jié)構(gòu)形式成為方法宏觀質(zhì)量控制的又一因素。前期調(diào)研發(fā)現(xiàn),是否可以及時(shí)獲得所需的“試驗(yàn)動(dòng)物”,即試驗(yàn)動(dòng)物的來源成為廢水毒性測(cè)試應(yīng)用至關(guān)重要的限制因子,因此,同一種類不同來源的試驗(yàn)魚對(duì)方法有怎樣的影響也需要通過宏觀質(zhì)量控制的研究予以確認(rèn)。傳統(tǒng)方法依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)段的“效應(yīng)-濃度曲線”推定未稀釋前的現(xiàn)狀毒性結(jié)果,由于預(yù)實(shí)驗(yàn)段“最大無致死”與“最小全致死”濃度均為節(jié)點(diǎn)(24或96 h)效應(yīng),而在某一節(jié)點(diǎn)恰當(dāng)?shù)倪_(dá)到“無或全”實(shí)驗(yàn)效應(yīng)的重現(xiàn)性很難控制,特別是96 h節(jié)點(diǎn)受試魚類的死亡數(shù)量變化已經(jīng)很小[2],微弱的影響也會(huì)形成節(jié)點(diǎn)前后漂移,其結(jié)果的重現(xiàn)性波動(dòng)可能影響預(yù)實(shí)驗(yàn)段曲線的線性,加之毒性物質(zhì)持續(xù)稀釋過程中可能存在濃度與效應(yīng)等比率跟隨性變化,兩者疊加更顯現(xiàn)方法預(yù)實(shí)驗(yàn)形式質(zhì)控認(rèn)定的重要。為此,研究?jī)烧唛g曲率匹配的可控性也成為方法學(xué)宏觀質(zhì)量控制的研究?jī)?nèi)容。

    綜上,研究針對(duì)樣品實(shí)驗(yàn)對(duì)應(yīng)的4個(gè)問題設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo):①試驗(yàn)魚種類的靈敏性選擇對(duì)方法檢出限的影響;②魚類毒性測(cè)定方法中是否采用魚類組合形式對(duì)方法的影響;③同種魚類不同來源對(duì)方法測(cè)定結(jié)果的影響;④多樣品強(qiáng)毒性至低毒性系列化同步稀釋條件下各稀釋度與毒性強(qiáng)度等比率變化的區(qū)間跟隨性波動(dòng)查找。特別增加了重鉻酸鉀、氯化汞溶液、杜邦萬靈殺蟲劑等已知毒物樣品的實(shí)驗(yàn),這些樣品基本可以保證在整體實(shí)驗(yàn)過程中不會(huì)引入可能的菌類以導(dǎo)致毒性被凈化降解的可能,也能夠保證多次實(shí)驗(yàn)條件下樣品的一致性,使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為可靠。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    泥鰍(成年,體重35~45 g);劍尾魚(成年,體長(zhǎng)6.0~6.5 cm);黑鰭紅月光魚(5月齡左右,體長(zhǎng)2.5~3.0 cm);斑馬魚(3 月齡左右幼魚,體長(zhǎng)2.3~2.8 cm);青鳉(3 月齡左右幼魚,體長(zhǎng)2.0~2.5 cm);紅鼻剪刀魚(3 月齡左右幼魚,體長(zhǎng)2.5~3.0 cm);虎皮魚(3 月齡左右幼魚,體長(zhǎng)2.0~2.5 cm);馬頭鰍(3 月齡左右幼魚,體長(zhǎng)5.5 ~6.5 cm);紅綠燈魚(3 月齡左右幼魚,體長(zhǎng)1.8 ~2.3 cm)等。

    1.2 毒性樣品

    氯化汞(3.2 mg/L及以下濃度)、重鉻酸鉀(825 mg/L及以下濃度)、杜邦萬靈殺蟲劑(6 g/L及以下濃度)、害光光殺蟲劑(1 g/L及以下濃度)、除草劑(50 mL/L及以下濃度)中間體化工廢水(樣品原液及以下各百分比濃度)等已知毒物;制藥類、化工類、印染、造紙、電子、電鍍等多行業(yè)未知毒性廢水。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    對(duì)應(yīng)目標(biāo)1的實(shí)驗(yàn)方法:為滿足實(shí)驗(yàn)一致性和重現(xiàn)性的要求,對(duì)多種魚多樣品進(jìn)行同步對(duì)比實(shí)驗(yàn),以獲得識(shí)別毒性等級(jí)的差異性比較。

    對(duì)應(yīng)目標(biāo)2的實(shí)驗(yàn)方法:符合檢出限要求且靈敏性接近的試驗(yàn)魚對(duì)不同毒物也應(yīng)具有感知的選擇性,采用更換各種選定試驗(yàn)魚分別對(duì)同一樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的方式,查找單一種類判定偏執(zhí)的可能性,采取魚類組合形式進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn),對(duì)2種情況下方法實(shí)驗(yàn)的可信性水平進(jìn)行分析并獲得結(jié)論。

    對(duì)應(yīng)目標(biāo)3的實(shí)驗(yàn)方法:同一種類的試驗(yàn)魚在國(guó)內(nèi)可以有不同的來源,有專業(yè)機(jī)構(gòu)定向培育、市場(chǎng)商品化培育等區(qū)別,市場(chǎng)化培育后還有體色的差異性等。采用不同來源但種屬、規(guī)格相同的魚進(jìn)行多樣品毒性測(cè)定對(duì)比實(shí)驗(yàn),如產(chǎn)生顯著差異,則建議使用特定來源的試驗(yàn)魚,反之,則獲得試驗(yàn)魚的途徑限制將被打破,監(jiān)管急需條件下及時(shí)獲得試驗(yàn)魚的障礙將破除。

    對(duì)應(yīng)目標(biāo)4的實(shí)驗(yàn)方法:經(jīng)典的毒性試驗(yàn)方法通常采取稀釋和預(yù)實(shí)驗(yàn)的方式進(jìn)行,預(yù)實(shí)驗(yàn)采取該樣本稀釋后“最小全致死”和“最大無致死”區(qū)間的段落建立稀釋百分比率與致死率間的對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線,由曲線經(jīng)計(jì)算獲得50%致死率對(duì)應(yīng)的稀釋百分比,并將該稀釋百分比率的倒數(shù)確定為毒性單位繼而獲得毒性評(píng)價(jià)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)要求被測(cè)毒性物質(zhì)由最低濃度(或毒性)到最高濃度(或毒性)的整個(gè)區(qū)間都能夠與預(yù)實(shí)驗(yàn)段的曲率相同而不應(yīng)出現(xiàn)階段性轉(zhuǎn)折的現(xiàn)象。然而,受試動(dòng)物在持續(xù)染毒過程中可能會(huì)對(duì)該毒性逐步產(chǎn)生抗體而又隨著染毒的加深而崩潰,毒物自身的致毒屬性在不同的濃度層級(jí)也會(huì)有“斷崖”現(xiàn)象,這樣的過程以及其他因素將導(dǎo)致線性延伸過程形成轉(zhuǎn)折性波動(dòng),影響數(shù)據(jù)結(jié)果質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)通過考察多種相同毒性毒物等比率稀釋過程中毒性強(qiáng)度線性是否存在陡然轉(zhuǎn)折的現(xiàn)象來證明這種離線存在的可能性。

    1.4 實(shí)驗(yàn)條件

    實(shí)驗(yàn)條件均依照或參考《水質(zhì) 物質(zhì)對(duì)淡水魚(斑馬魚)急性毒性測(cè)定方法》(GB/T 13267—1991)[3]、《工業(yè)廢水魚類急性毒性試驗(yàn)》(GB/T 21814—2008)[4]等條款執(zhí)行;部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果依照半致死條件下試驗(yàn)魚類持續(xù)染毒時(shí)數(shù)(耐毒時(shí)數(shù))的差異進(jìn)行結(jié)果判定。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 試驗(yàn)魚種類的靈敏性選擇對(duì)方法檢出限構(gòu)成的影響

    表1顯示了部分小型魚對(duì)部分制藥企業(yè)廢水的生物毒性測(cè)試結(jié)果。

    表1 部分小型魚對(duì)部分制藥企業(yè)廢水的生物毒性測(cè)試結(jié)果

    由表1可見,雖同為小型魚類,在廢水毒性試驗(yàn)中,其靈敏性的差異仍表現(xiàn)明顯,黑鰭紅月光魚為紅色劍尾魚的父母代種類,與灰色劍尾魚的生物學(xué)特點(diǎn)相似,耐毒性強(qiáng)。該魚與紅鼻剪刀魚或與虎皮魚相比較,對(duì)同一樣品測(cè)定結(jié)果有明顯差異,最大時(shí)可達(dá)2個(gè)以上毒性等級(jí),一般情況下也達(dá)1個(gè)毒性等級(jí)。研究在3 a多時(shí)間的數(shù)次實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了同樣目標(biāo)的比較,樣品及試驗(yàn)魚類采集區(qū)涵蓋了東北、江蘇、上海等地,這種由魚類種屬差異導(dǎo)致的對(duì)毒性感知靈敏性的差異極為普遍,經(jīng)實(shí)驗(yàn)選擇,在各省市當(dāng)?shù)厮迨袌?chǎng)易獲的小型魚類中,紅鼻剪刀魚、虎皮魚、馬頭鰍、雪鯛、紅綠燈魚等為廢水毒性測(cè)定高靈敏性層級(jí)的試驗(yàn)魚類;其次是中等靈敏度層級(jí)的斑馬魚、孔雀魚和青鳉;再次是靈敏性較遲鈍層級(jí)的劍尾魚、黑鰭紅月光魚等?;⑵~等靈敏性強(qiáng)的試驗(yàn)魚類應(yīng)成為預(yù)警監(jiān)管方法試驗(yàn)用魚的首選。

    2.2 是否采用組合魚形式對(duì)方法測(cè)定結(jié)果的影響

    1.4倍率稀釋條件下害光光殺蟲劑、杜邦萬靈殺蟲劑及重鉻酸鉀等各6組梯度斑馬魚與虎皮魚96 h內(nèi)半致死差異比較的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

    表2 幾種等強(qiáng)度毒性物質(zhì)等比率稀釋后的強(qiáng)度改變離散實(shí)驗(yàn)情況

    由表2可見,多次實(shí)驗(yàn)中斑馬魚對(duì)于害光光殺蟲劑的弒殺作用有明顯的抗性,而該魚在其他毒物中的表現(xiàn)則十分正常,這樣的現(xiàn)象也曾在某除草劑的毒性試驗(yàn)中出現(xiàn)過,可見,單憑一種試驗(yàn)魚的實(shí)驗(yàn)結(jié)果就對(duì)毒物作出結(jié)論性評(píng)價(jià)會(huì)出現(xiàn)不公正現(xiàn)象。廢水毒性的監(jiān)管測(cè)定應(yīng)采用多種小型魚共同進(jìn)行同一實(shí)驗(yàn)的組合技術(shù)形式。

    2.3 同種魚類不同來源對(duì)方法測(cè)定結(jié)果的影響

    配置多種廢水的混合液進(jìn)行了3種濃度條件下對(duì)應(yīng)致死率(百分率)的持續(xù)染毒時(shí)間實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表3。

    表3 不同來源的同種魚類在3種實(shí)驗(yàn)液中對(duì)應(yīng)致死百分率的持續(xù)染毒時(shí)間表

    由表3可見,在規(guī)格、健康程度基本相同條件下,同種魚類雖然來源不同,體色不同,仍沒有使實(shí)驗(yàn)的總差異率超過10%(絕大多數(shù)不超過5%),沒有構(gòu)成對(duì)廢水毒性測(cè)定結(jié)果的明顯影響。于洋等[5]在使用電鍍廢水進(jìn)行的毒性試驗(yàn)中,選擇了不同來源的斑馬魚、劍尾魚、紅鼻剪刀魚、虎皮魚、馬頭鰍、青鳉、紅綠燈魚等進(jìn)行同樣的測(cè)試,也證明不同來源的同種屬試驗(yàn)魚在規(guī)格、健康程度基本相近的條件下,不會(huì)對(duì)廢水毒性測(cè)定的結(jié)果產(chǎn)生不利影響。

    2.4 稀釋度與毒性強(qiáng)度等比率變化的區(qū)間跟隨性波動(dòng)查找

    表4給出斑馬魚在5種差異性毒物同步稀釋液中持續(xù)染毒達(dá)半致死時(shí)間表。表5為氯化汞濃度為0.595 mg/L及以下濃度1.4倍率稀釋條件下的毒性強(qiáng)度半致死時(shí)間表。

    由表4及表5可見,等比率稀釋條件下,其毒物毒性變化并不一定能夠與稀釋比率保持同步,且明顯存在著跟隨性波動(dòng),也很可能發(fā)生類似氯化汞濃度為0.595 mg/L前后毒性效應(yīng)驟然變化的現(xiàn)象,具有這樣階段性變化的毒性物質(zhì)很有可能導(dǎo)致經(jīng)典方法預(yù)實(shí)驗(yàn)階段與其他段落的線性沖突。

    表4 斑馬魚在5種差異性毒物同步稀釋液中持續(xù)染毒達(dá)半致死時(shí)間表

    表5 氯化汞0.595 mg/L及以下濃度1.4倍率稀釋條件下的毒性強(qiáng)度半致死時(shí)間表

    因此,在未知毒物的實(shí)驗(yàn)中,在不能證明被測(cè)毒性物質(zhì)的整體稀釋過程濃度-效應(yīng)線性連續(xù)性穩(wěn)定變化的情況下,進(jìn)行先行稀釋再行反推求得現(xiàn)狀毒性強(qiáng)度的實(shí)驗(yàn)形式存在嚴(yán)重的宏觀質(zhì)量控制漏洞。由于廢水毒性預(yù)警監(jiān)管測(cè)試的主要目標(biāo)是獲得現(xiàn)狀條件下廢水的毒性,而非稀釋某倍數(shù)的毒性,因此,直接測(cè)定現(xiàn)狀,直接表述樣品原液的毒性等級(jí)才是廢水毒性測(cè)試所需要的方法形式。

    3 結(jié)論與建議

    3.1 結(jié)論

    廢水中未知、混合毒物毒性現(xiàn)狀狀態(tài)的常規(guī)化預(yù)警監(jiān)管測(cè)定與傳統(tǒng)的已知毒物毒性的生態(tài)保護(hù)影響測(cè)定不僅存在著測(cè)試目的性差異,更存在應(yīng)用時(shí)效性要求的差異。服務(wù)于生態(tài)保護(hù)的傳統(tǒng)方法移植到廢水預(yù)警監(jiān)管領(lǐng)域存在著宏觀質(zhì)量控制等多方面問題。首先,能夠滿足GB/T 13267—1991和GB/T 21814—2008國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求的試驗(yàn)魚在廢水未知毒性現(xiàn)狀狀態(tài)的分析中靈敏性不足,導(dǎo)致了方法的檢出限至少相差1個(gè)等級(jí);第二,上述國(guó)標(biāo)為單一魚的急性毒性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn),使用單一的魚類對(duì)廢水做出評(píng)價(jià)結(jié)論,其可信性水平較組合形式的試驗(yàn)方法低;第三,不同來源的試驗(yàn)魚類在健康、體重等表面條件基本一致的前提下,不會(huì)對(duì)廢水的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生不利影響,使用當(dāng)?shù)厮迨袌?chǎng)的觀賞魚(如斑馬魚)可以起到近交系斑馬魚相同的效果,哪怕體色的不同亦不會(huì)影響結(jié)果的正確性;第四,傳統(tǒng)方法預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得96 h節(jié)點(diǎn)“最小全致死濃度”波動(dòng)帶給實(shí)驗(yàn)的繁瑣性和不確定的時(shí)間消耗,更存在線性質(zhì)量控制難于操作的問題,預(yù)實(shí)驗(yàn)段曲線可能存在的誤差很容易導(dǎo)致反推整體線性結(jié)果的缺陷。在以現(xiàn)狀毒性水平為實(shí)驗(yàn)結(jié)果需求的水污染毒性監(jiān)管當(dāng)中,依據(jù)有稀釋過程和預(yù)實(shí)驗(yàn)的技術(shù)可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏離,從而影響管理判定的正確性。綜上,建議以現(xiàn)狀表述為主要目標(biāo)的廢水未知毒性測(cè)定盡可能回避稀釋的實(shí)驗(yàn)過程。

    3.2 建議

    相關(guān)研究已建立了水污染源生物毒性監(jiān)測(cè)技術(shù)體系,提出了廢水毒性測(cè)試的“時(shí)間-劑量效應(yīng)”方法技術(shù)[6],可以成為常規(guī)化廢水毒性預(yù)警監(jiān)管的實(shí)用方法技術(shù)。廢水毒性的存在極為普遍[7],廢水毒性監(jiān)測(cè)的常規(guī)化運(yùn)行多年以來未能實(shí)現(xiàn),研究破解了關(guān)鍵的制約因子,給方法運(yùn)行以可行之路,方法的普及直接關(guān)系到環(huán)境監(jiān)管從已知污染跨越到未知污染的深度。中共中央“關(guān)于全面深化改革若干重大問題的決定”(以下簡(jiǎn)稱“決定”)提出了改革生態(tài)環(huán)境保護(hù)管理體制的要求。其中“建立和完善嚴(yán)格監(jiān)管所有污染物排放的環(huán)境保護(hù)管理制度”是“決定”的核心內(nèi)容也是防治污染、保障人群健康的一般要求,而只有通過生物毒性預(yù)警監(jiān)測(cè)項(xiàng)目的常規(guī)化普及,大范圍發(fā)現(xiàn)毒性并配合大型儀器的進(jìn)一步確認(rèn)分析,才能由毒性索跡追蹤逐步實(shí)現(xiàn)“決定”的目標(biāo),才能促進(jìn)廢水污染預(yù)警監(jiān)測(cè)體系建設(shè)的發(fā)展,有的放矢為環(huán)境監(jiān)管提供更好的支持。

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    [4]GB/T 21814—2008 工業(yè)廢水魚類急性毒性試驗(yàn)[S].

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