溫度對現(xiàn)場熒光法測定水體中葉綠素a的影響

呂鵬翼，崔建升

河北科技大學環(huán)境科學與工程學院河北省污染防治生物技術(shù)實驗室，河北 石家莊 050018

水體中葉綠素a含量是表征浮游植物生物量的一個重要指標［1］，當前以熒光原理為基礎(chǔ)，浮游植物中葉綠素a含量在線快速檢測裝置的研發(fā)已成為環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域的研究熱點之一［2-4］。理論上關(guān)于溫度對離體葉綠素a測定結(jié)果的影響研究已相對成熟，已知高溫條件下葉綠素a不穩(wěn)定、易降解［5-7］;許金鉤等［8］在所著的《熒光分析法》中指出溫度對熒光物質(zhì)的熒光強度有顯著的影響，一般熒光物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率和熒光強度會隨著溫度的降低而升高。在現(xiàn)場測定環(huán)境中熒光儀測定對象主要為活體藻中的葉綠素a，一般不同季節(jié)、一天中不同時間段水體的溫度會有所差異，故溫度會對活體藻中葉綠素a的測定產(chǎn)生一定影響。有研究［9-10］報道，天然海水中活體藻在12～30℃范圍內(nèi)，溫度每升高1℃，熒光降低1.4%。廈門市環(huán)境監(jiān)測中心站［11］采用YSI葉綠素傳感器探頭對廈門西港葉綠素含量進行監(jiān)測，在肯定葉綠素水質(zhì)自動監(jiān)測儀輕便、操作簡單、維護量小、可進行實時監(jiān)測等優(yōu)點的同時也指出葉綠素傳感器易受溫度的影響。Catherine等［12］使用德國bbe葉綠素在線分析儀對法國境內(nèi)的大量湖泊、水庫進行了大規(guī)模的測量，結(jié)果表明通過對水體中葉綠素 a的測定分析能夠很好地估算浮游植物的生物量，但同時指出溫度等環(huán)境因素會對葉綠素熒光產(chǎn)生怎樣的影響仍需要進行深入研究。以往研究多側(cè)重溫度升高對熒光法測定葉綠素a的直觀影響且實驗對象多為葉綠素a萃取液［5］，關(guān)于溫度對熒光法測定活體藻中葉綠素a的影響的研究少見報道。對此，分別以純?nèi)~綠素a和活體藻為實驗對象研究了溫度對熒光法測定葉綠素a的影響，首次提出了不同狀態(tài)下葉綠素a(離體葉綠素a和活體藻中的葉綠素a)的溫度系數(shù)，并測試了溫度對自主研發(fā)的水體葉綠素現(xiàn)場檢測儀的影響，對水體葉綠素在線監(jiān)測系統(tǒng)的完善具有一定的理論意義。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

RF5301熒光分光光度計(日本)，水體葉綠素現(xiàn)場檢測儀，HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋。

葉綠素 a標準品(10 mg，日本)，銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)、斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa，BG-11培養(yǎng)基)，90%乙醇。

1.2 實驗方法

1.2.1 RF5301熒光分光光度計

1)取葉綠素a標準品用90%乙醇配制濃度為1.0 μg/mL的葉綠素 a樣品置于恒溫水浴鍋中在60℃條件下恒溫20 min后立即將樣品取出，用熒光分光光度計在“Time Course”模式下連續(xù)測定10 min，采樣間隔和采樣點自動設(shè)定。

2)取葉綠素a標準品用90%乙醇配制濃度為0.50 μg/mL的葉綠素 a樣品，測定不同溫度水平(20、30、40、50、60、70 ℃)下樣品的熒光強度值并求其降解率。

3)取葉綠素a標準品以90%乙醇為溶劑，分別 配 制 一 定 濃 度 梯 度 (0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL)的純品葉綠素a樣品系列，設(shè)置樣品測定溫度范圍為5～70℃，按照從低溫到高溫的順序依次測定相同濃度的葉綠素a樣品的熒光強度值。分析溫度對不同濃度的葉綠素a的影響是否具有一致性，并計算出葉綠素a的溫度系數(shù)。

4)一般不同水體所含浮游藻類的種類不同，為更好地表征溫度對實際水體中活體藻的影響，選取水體中的銅綠微囊藻、斜生柵藻、蛋白核小球藻為實驗藻種。分別取其配制不同濃度的活體藻樣品，設(shè)置實驗溫度范圍為10～70℃，溫度間隔為5℃，每個樣品恒溫20 min后測定其熒光強度值，并求其溫度系數(shù)。

RF5301熒光分光光度計測定葉綠素a的參數(shù)設(shè)置為激發(fā)波長 436.0nm，發(fā)射波長672.0 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5.0 nm。

1.2.2 水體葉綠素現(xiàn)場檢測儀

配制濃度為60 μg/L的葉綠素a樣品，將水體葉綠素現(xiàn)場檢測儀與待測樣品同時置于恒溫水浴鍋，調(diào)節(jié)溫度以使溶液溫度與水體葉綠素現(xiàn)場檢測儀溫度相同，模擬自然測定環(huán)境。設(shè)置溫度范圍為15～40℃，溫度間隔為1℃。研究溫度對水體葉綠素現(xiàn)場檢測儀測定結(jié)果的影響，確定檢測儀最佳測定溫度范圍。

水體葉綠素現(xiàn)場檢測儀測定條件為“連續(xù)測量”模式，測量間隔30 s，每個樣品連續(xù)測量10 min，取其平均值。

在實驗過程中樣品均為現(xiàn)測現(xiàn)配，在測定過程中待測樣品需避光放置，避免葉綠素a發(fā)生光解。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度對葉綠素a熒光強度的影響

圖1為葉綠素a的熒光強度值隨時間的變化趨勢。

圖1 葉綠素a的熒光強度值隨時間的變化趨勢

隨著時間的延長，樣品溫度會逐漸降低至室溫(約20℃)，葉綠素a樣品的熒光強度隨著溫度降低呈上升趨勢，當樣品溫度達到室溫后熒光強度值基本趨于平緩。

不同溫度水平下葉綠素a樣品的熒光強度值如表1所示。

表1 不同溫度水平下葉綠素a樣品的熒光強度值及降解率

由表1可見，以20℃條件下測定的熒光強度值為對照組，隨著溫度的升高葉綠素a的降解程度加大。30℃時葉綠素a的降解率為2.34%;當溫度為70℃時，葉綠素a的降解率達到10.08%左右，說明溫度對葉綠素a降解程度有顯著影響。

不同濃度葉綠素a樣品的熒光強度隨溫度的變化情況如圖2所示。

圖2 不同濃度葉綠素a樣品的熒光強度值隨溫度的變化情況

由圖2可見，隨著溫度的升高葉綠素a樣品的熒光強度值總體呈下降趨勢，不同濃度的樣品均符合此變化規(guī)律。分析原因主要有2方面:①溫度的升高使部分葉綠素a降解生成了以脫鎂葉綠素a為主的降解產(chǎn)物，兩者熒光特性有所差異，從而降低了葉綠素a的熒光量子產(chǎn)率;②由于溫度升高提高了分子動能，促進了分子間流動，使液體動力增加粘度減小，增大了熒光分子和溶劑分子的碰撞機會，熒光物質(zhì)分子通過其他分子的碰撞造成內(nèi)部能量的轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致溫度淬滅，降低了熒光物質(zhì)的熒光強度。

為更清楚直觀地觀察葉綠素a的熒光強度隨溫度的變化情況，取濃度為1.0 μg/mL樣品系列進行具體分析。圖3為5～70℃范圍內(nèi)葉綠素a樣品熒光強度隨溫度的變化情況。

圖3 5～70℃范圍內(nèi)1.0 μg/mL葉綠素a樣品的熒光強度值隨溫度變化示意圖

由圖3可知，在5～20℃溫度范圍內(nèi)熒光強度值隨溫度的升高下降幅度較小，即低溫條件下葉綠素a降解率較低且低溫狀態(tài)下溫度對葉綠素a分子能量轉(zhuǎn)移影響較小，溫度淬滅效應(yīng)不顯著。在20～50℃范圍內(nèi)熒光強度值與溫度呈良好的負線性相關(guān)，回歸方程為y=－0.893x+307.82，回歸系數(shù)為0.999 5;在50℃左右時，1.0 μg/mL葉綠素a樣品的熒光強度與溫度的關(guān)系曲線出現(xiàn)了拐點，變化趨于平穩(wěn)。

2.2 葉綠素a溫度系數(shù)實驗

一般而言，熒光物質(zhì)的熒光強度隨溫度的降低而增強，溫度的升高與熒光強度的減弱在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。溫度每升高1℃，熒光減弱的百分數(shù)稱為其溫度系數(shù)，不同熒光物質(zhì)的溫度系數(shù)不同。計算葉綠素a的溫度系數(shù)(TC)，如式(1)所示。不同濃度葉綠素a樣品的溫度系數(shù)列于表2。由表2可以看出，葉綠素a溫度系數(shù)在0.29% ～0.30%之間變動，取其平均值(0.295%)為葉綠素a的溫度系數(shù)。該值反映的是葉綠素a的熒光強度隨溫度變化的特性。

式中:TC為葉綠素a的溫度系數(shù);T1、T2為不同的測定溫度;F1為葉綠素a在T1溫度下的熒光值;F2為葉綠素a在T2溫度下的熒光值。

表2 不同濃度葉綠素a樣品的溫度系數(shù)

2.3 溫度對活體藻中葉綠素a熒光強度的影響

圖4為不同藻類的葉綠素a熒光強度隨溫度的變化情況。

圖4 不同藻類的熒光強度隨溫度的變化情況

由圖4可知，活體藻的熒光強度值隨著溫度的升高同樣呈下降趨勢，與純?nèi)~綠素a相比線性關(guān)系較差，分析原因可能是與純?nèi)~綠素a相比活體藻結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，逆境環(huán)境下溫度脅迫使活體藻結(jié)構(gòu)、光合速率或葉綠體的微環(huán)境發(fā)生了改變，從而影響了葉綠素a的熒光特性［13］。

圖5為斜生柵藻、蛋白核小球藻及銅綠微囊藻在10～45℃范圍內(nèi)的原藻液熒光強度與溫度的關(guān)系曲線。

圖5 10～45℃范圍內(nèi)不同藻類的熒光強度隨溫度的變化情況

分析圖5可知，隨溫度的升高3種活體藻的熒光強度值均呈下降趨勢且相關(guān)系數(shù)均在0.97以上，運用式(1)計算得斜生柵藻的溫度系數(shù)約為1.09%，蛋白核小球藻的溫度系數(shù)約為1.17%，銅綠微囊藻的溫度系數(shù)約為1.14%。

2.4 溫度對水體葉綠素現(xiàn)場檢測儀測定結(jié)果的影響

溫度過高或過低均會對葉綠素a的熒光強度值產(chǎn)生影響，在實際測量環(huán)境中，環(huán)境溫度除對浮游植物的熒光特性產(chǎn)生影響從而降低測定結(jié)果的準確性外，溫度對葉綠素熒光儀的光電倍增管的信號輸出也會產(chǎn)生一定影響，對此采用熒光強度隨溫度變化的百分率作為補償因子對水體葉綠素現(xiàn)場檢測儀進行了溫度補償，以降低溫度對檢測儀的影響。

以濃度為60 μg/L的26個葉綠素 a樣品為測定對象，用水體葉綠素現(xiàn)場檢測儀在15～40℃溫度范圍內(nèi)測定樣品的濃度值，設(shè)置溫度間隔為1℃。測定結(jié)果如表3所示。

表3 不同溫度水平下水體葉綠素現(xiàn)場檢測儀測定值及其相對誤差

由表3可見，在15～40℃溫度范圍內(nèi)測定值與真實值的相對誤差為9.26% ～－15.45%，在15～35℃溫度范圍內(nèi)測定值與真實值的相對誤差為±10%。分析結(jié)果可知，溫度越高檢測儀測定值與真實值的相對誤差越大，測定結(jié)果偏低主要是由葉綠素a高溫降解所貢獻;雖然對檢測儀的輸出信號進行了溫度補償，但在實際測定中溫度對檢測儀的影響是難以避免的。此外，隨著溫度的升高，檢測儀測定結(jié)果整體呈下降趨勢，該結(jié)果與溫度對實驗室熒光法測定葉綠素a的影響趨勢一致。實驗表明，在15～35℃溫度范圍內(nèi)，水體葉綠素現(xiàn)場檢測儀測定結(jié)果可取，滿足一般水體測定環(huán)境的溫度要求。

3 結(jié)論

分別以純?nèi)~綠素a和銅綠微囊藻、斜生柵藻及蛋白核小球藻3種活體藻為實驗對象研究了不

同溫度水平下葉綠素a及活體藻的相對熒光強度的變化情況。結(jié)果顯示，不同狀態(tài)的葉綠素a的熒光強度值均會隨溫度的升高而降低，分析原因主要是由葉綠素a高溫降解和溶液粘度減小導(dǎo)致的溫度熒光淬滅所引起;不同狀態(tài)的葉綠素a溫度系數(shù)的導(dǎo)出對進一步研究葉綠素a的熒光特性隨溫度的變化規(guī)律意義重大，對水體葉綠素現(xiàn)場檢測儀的溫度校準和提高水體中葉綠素a現(xiàn)場檢測裝置的準確度具有一定參考價值。

［1］王俊，李洪志．渤海近岸葉綠素和初級生產(chǎn)力研究［J］．海洋水產(chǎn)研究，2002，23(1):23-28．

［2］Gregor J， Marsalek B． Freshwater phytoplankton quantification by chlorophyll a:a comparative study of in vitro，in vivo and in situ methods［J］．Water Research，2004，38(3):517-522．

［3］Izydorczyk K，Carpentier C，Mrowczynski J，et al．Establishment of an alert level framework for cyanobacteria in drinking water resources by using the algae online analyser for monitoring cyanobacterial chlorophyll a［J］．Water Research，2009，43(4):989-996．

［4］Tammi L R，Evelyn L，James L P，et al．Spectral fluorometric characterization of phytoplankton community composition using the Algae Online Analyser［J］．Water Research ，2010，44(8):2 461-2 472．

［5］張武昌，王榮．光和溫度對葉綠素a和脫鎂葉綠酸a降解的影響［J］．海洋科學，2000，24(4):50-52．

［6］李翠華，張魯勉，何小英．葉綠素a降解產(chǎn)物及其衍生物應(yīng)用研究［J］．汕頭大學醫(yī)學院學報，2002，15(2):121-122．

［7］陰金香，楊楷．天然綠色植物中去鎂葉綠素的分離和鑒定［J］．廣西師范大學學報(自然科學版)，2003，21(z1):286-287．

［8］許金鉤，王尊本．熒光分析法［M］．3版．北京:科學出版社，2006:49-63．

［9］Lorenzen C J． A method for the continuous measurement of in vivo chlorophyll concentration［J］．Deep-Sea Res，1966，13(2):223-227．

［10］丁永耀，張欣梅，呂培頂，等．熒光法測定海中生物體內(nèi)的葉綠素 a［J］．海洋學報，1983，5(8):340-348．

［11］張江龍．葉綠素檢測儀器在水質(zhì)自動監(jiān)測應(yīng)用中的優(yōu)劣淺析［J］．現(xiàn)代科學儀器，2007(1):41-42．

［12］Catherine A，Escoffier N，Belhocine A，et al．On the use of the FluoroProbe，a phytoplankton quantification method based on fluorescence excitation spectra for large-scale surveys of lakes and reservoirs［J］．Water Research，2012，46(6):1 771-1 784．

［13］王靜．高溫、高光強脅迫對植物離體葉綠體光合色素的降解及沙丘蘆葦純化內(nèi)含鉚對其減緩作用的研究［D］．蘭州:蘭州大學，2008．