通過檢測非結(jié)構(gòu)蛋白抗體評價口蹄疫疫苗純度的研究

趙麗霞，關(guān)平原，陳君彥，李超華，高 瑛，牛秀嶺，張立華，趙丹彤，郝雪斌，李 敏，高日明，武春芳

（1.金宇保靈生物藥品有限公司，呼和浩特010030；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，呼和浩特010018）

通過檢測非結(jié)構(gòu)蛋白抗體評價口蹄疫疫苗純度的研究

趙麗霞1，關(guān)平原2，陳君彥1，李超華1，高 瑛1，牛秀嶺1，張立華1，趙丹彤1，郝雪斌1，李 敏1，高日明1，武春芳1

（1.金宇保靈生物藥品有限公司，呼和浩特010030；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，呼和浩特010018）

為探索通過檢測非結(jié)構(gòu)蛋白（NSPs）抗體的方法評價口蹄疫疫苗純度的可行性，用不同純化工藝制備口蹄疫O型、亞洲1型、A型三價滅活疫苗，重復(fù)免疫牛至少3次后，定期檢測NSPs的ELISA抗體并統(tǒng)計分析抗體情況。結(jié)果顯示，高度純化疫苗組的NSPs抗體陰性率遠高于普通純化疫苗組，表明通過檢測NSPs抗體評價口蹄疫疫苗純度可以作為質(zhì)量控制的一種方法。

口蹄疫疫苗；非結(jié)構(gòu)蛋白；抗體；純度

口蹄疫（Foot and Mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的在偶蹄動物間傳播的烈性傳染?。?］。大多數(shù)亞洲、非洲、南美洲國家一直都通過注射滅活疫苗的辦法來控制該病的流行［2］。因此，生產(chǎn)高質(zhì)量FMD疫苗是防控口蹄疫的關(guān)鍵要素之一。盡管國內(nèi)疫苗的生產(chǎn)工藝已有提高，但FMD疫苗仍會存在含有痕跡量非結(jié)構(gòu)蛋白（Nonstructural proteins，NSPs）的風(fēng)險。NSPs（如3A、3B、2B、2C、3ABC）相對保守［4］，參與病毒復(fù)制、多聚蛋白裂解和病毒顆粒的組裝過程［3］。FMD疫苗免疫特別是多次重復(fù)免疫之后，痕跡量的NSPs可能刺激機體產(chǎn)生抗體。OIE建議，通過檢測接種至少三次口蹄疫疫苗的動物血清，以是否產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，來評價疫苗的純度［5］。

目前，國內(nèi)口蹄疫滅活疫苗抗原純化濃縮工藝水平有待進一步完善和優(yōu)化。一些嚴格控制FMD疫苗質(zhì)量的生產(chǎn)廠家通過改進生產(chǎn)工藝，大大降低了疫苗的總蛋白含量。但國內(nèi)對于疫苗純化程度、蛋白含量及NSPs產(chǎn)生的詳細報道還很少，因此本研究參照OIE推薦的方法，進行了NSPs抗體檢測的實驗研究。

1 材料與方法

1.1 制苗用毒株和試劑 口蹄疫O／Mya98／BY／2010株、Asia1／JSL／06株和Re－A／WH／09株抗原，均由金宇保靈生物藥品有限公司提供。ISA206復(fù)合型油佐劑，購自法國SEPPIC公司。牛、羊口蹄疫病毒抗體檢測試劑盒（FMD－3ABC Bo－Ov），購自美國愛德士生物科技公司。

1.2 實驗動物 犢牛（O型、亞洲1型、A型液相阻斷ELISA抗體滴度≤1∶8，NSPs抗體為陰性），來源于定點供應(yīng)基地。成年牛，來源于動物免疫背景清晰的養(yǎng)殖場。

1.3 實驗疫苗的配制 將高度純化滅活抗原O／Mya98／BY／2010株、Asia1／JSL／06株、Re－A／WH／09株抗原，普通純化滅活抗原O／Mya98／BY／2010株、Asia1／JSL／06株、Re－A／WH／09株抗原，分別按重量比1∶1，與206佐劑充分乳化制備成口蹄疫O型、亞洲1型、A型三價滅活疫苗，將其分別編為高度純化組C001、高度純化組C002、普通純化組P001和普通純化組P002，2～8℃?zhèn)溆茫瑒┝? mL／頭份。

1.4 146S、蛋白和內(nèi)毒素含量的檢測 將上述4批疫苗（C001、C002、P001、P002）進行146S、總蛋白含量和內(nèi)毒素含量的檢測。

1.5 實驗疫苗免疫后NSPs抗體的檢測 選取上述4批口蹄疫O型、亞洲1型、A型三價滅活疫苗免疫犢牛，按疫苗分 4組（C001、C002、P001、P002），每組8頭牛，雙倍頭劑免疫2 mL／頭，重復(fù)免疫接種疫苗3次，免疫間隔時間30 d［5］。同時設(shè)5頭牛做空白對照組。在首免14 d、28 d，二免14 d、28 d，三免14 d、28 d、56 d，采血分離血清，定期利用牛、羊口蹄疫病毒抗體檢測試劑盒（FMD－3ABC Bo－Ov）跟蹤檢測其NSPs抗體。

1.6 免疫養(yǎng)殖場NSPs抗體的檢測 選擇免疫歷史背景清楚的養(yǎng)殖場，選同齡牛300頭隨機分為3組（E組、Y組、N組，每組100頭），E組免疫高度純化疫苗，Y組免疫普通純化疫苗，N組免疫普通純化疫苗和高度純化疫苗。分別采集血清，利用牛、羊口蹄疫病毒抗體檢測試劑盒（FMD－3ABC Bo－Ov）檢測其NSPs抗體，對比分析NSPs抗體情況。

2 結(jié)果

2.1 實驗疫苗146S含量、總蛋白含量和內(nèi)毒素含量檢測結(jié)果 實驗疫苗進行146S含量、總蛋白含量和內(nèi)毒素含量的檢測，結(jié)果詳見表1。高度純化疫苗組的146S含量高于普通純化疫苗組，而其總蛋白含量低于普通純化疫苗組。兩組實驗疫苗的內(nèi)毒素均小于0.45 EU／mL。

表1 實驗疫苗146S含量、總蛋白含量和內(nèi)毒素含量檢測結(jié)果

2.2 實驗疫苗免疫后NSPs抗體檢測結(jié)果 將4批實驗疫苗重復(fù)免疫實驗犢牛3次，定期采血檢測結(jié)果見表2。高度純化組C001和C002牛三免后56 d一直沒有出現(xiàn)NSPs抗體陽性；但普通純化組P001在二免14 d就出現(xiàn)NSPs抗體陽性，普通純化組P002則在一免28 d就出現(xiàn)NSPs抗體陽性。

2.3 免疫養(yǎng)殖場NSPs抗體的檢測結(jié)果 經(jīng)高度純化疫苗和普通純化疫苗免疫的E、N、Y組NSPs抗體檢測結(jié)果見表3。免疫高度純化疫苗E組的NSPs抗體陰性率為98%；免疫普通純化疫苗和高度純化疫苗N組的NSPs抗體陰性率為61%；免疫普通純化疫苗Y組的NSPs抗體陰性率僅為32%。

表2 實驗疫苗免疫后NSPs抗體檢測結(jié)果

表3 養(yǎng)殖場三個免疫組NSPs抗體的檢測結(jié)果

3 討論

由實驗疫苗免疫犢牛后NSPs抗體檢測結(jié)果可知，高度純化疫苗組重復(fù)免疫3次牛后，直到三免后56d仍未出現(xiàn)NSPs抗體陽性，說明疫苗純化效果比較好；普通純化疫苗組經(jīng)過重復(fù)免疫3次牛后，在不同時間段出現(xiàn)NSPs抗體陽性，究其原因可能與普通純化疫苗多次重復(fù)免疫之后，會產(chǎn)生痕跡量的NSPs蛋白有關(guān)［5］。

由三個免疫養(yǎng)殖場NSPs抗體的檢測結(jié)果可知，高度純化抗原制備的疫苗免疫動物后NSPs抗體陰性率遠高于普通純化疫苗組。由此表明，NSPs抗體的陰性率與疫苗抗原的純化程度相關(guān)。

目前，通過用凱氏定氮法或lowrry法檢測口蹄疫疫苗總蛋白含量，為控制疫苗蛋白含量起到了一定的指導(dǎo)作用，但對于評估疫苗非結(jié)構(gòu)蛋白產(chǎn)生的情況，不具有完全等效性，所以為達到質(zhì)量預(yù)防的目的應(yīng)開發(fā)一種能夠?qū)崟r監(jiān)控疫苗生產(chǎn)過程中非結(jié)構(gòu)蛋白的評估方法。據(jù)某試劑盒廠家介紹，利用口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白液相阻斷ELISA檢測試劑盒，能夠定量檢測病毒培養(yǎng)液中的NSPs，從而實時監(jiān)控生產(chǎn)過程中去除NSPs成分的效果，可以應(yīng)用于疫苗質(zhì)量控制，但此方法目前國內(nèi)尚待應(yīng)用測試。

口蹄疫疫苗的質(zhì)量評價，除安全性、效力（PD50）、146S含量、總蛋白含量、內(nèi)毒素含量等檢測指標外，NSPs抗體的檢測也可以為評價口蹄疫疫苗純度提供一定的指導(dǎo)意義。眾所周知，感染口蹄疫病毒動物的NSPs抗體為陽性［5］，免疫非純化疫苗也會產(chǎn)生NSPs抗體陽性，這種情況會對區(qū)分感染與免疫造成干擾，同時影響免疫效果。通過本實驗可以證明高度純化口蹄疫疫苗免疫動物后NSPs抗體為陰性，因此，提高疫苗純化效果和相應(yīng)的NSPs抗體檢測方法結(jié)合使用，可以為將來區(qū)分感染與免疫群組提供數(shù)據(jù)支持，為口蹄疫防控及凈化起到積極作用。

［1］江鵬斐，謝慶閣.應(yīng)用口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)分感染動物和注苗動物［J］.中國獸醫(yī)科技，1999，29（12）：47－48.

［2］唐海波，童曉輝.歐盟口蹄疫政策發(fā)生重大改變［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2003，23（6）：572.

［3］畢研麗，沈小燕，才學(xué)鵬，等.用口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)分注苗動物和自然感染動物研究進展［J］.生物技術(shù)通訊，2008，19（3）：448.

［4］De Diego M，Brocchi E，Mackay D，et al.The non－structural polyprotein 3ABC of foot－and－mouth disease virus as a diagnostic antigen in ELISA to differentiate infected from vaccinated cattle［J］.Arch Virol，1997，142（10）：2021－2033.

［5］OIE.Foot and mouth disease［M］／／OIE Terrestrial Manual.2012：20－21.

（編 輯：李文平）

Study on the Foot－and－Mouth Disease Vaccine Purity by Testing for Antibodies against Nonstructural Proteins

ZHAO Li－xia1，GUAN Ping－yuan2，CHEN Jun－yan1，LI Chao－h(huán)ua1，GAO Ying1，NIU Xiu－ling1，ZHANG Li－h(huán)ua1，ZHAO Dan－tong1，HAO Xue－bin1，LI Min1，GAO Ri－ming1，WU Chun－fang1
（1.Jinyu Baoling Biopharmaceutital Ltd.Company，Hohhot010030，China；2.Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot010018，China）

To examine the feasibility of evaluating the purity of the foot－and－mouth disease vaccine by testing the nonstructural proteins ELISA antibodies，the type O，type Asia 1，type A inactivated foot－and－mouth disease vaccines that were purified and processed differently immunized the cattle repeatedly at least three times.Hereafter，the nonstructural proteins ELISA antibodies were monitored regularly，statistics and analysis on the results of the NSPs ELISA antibodies were collected.It has shown that the negative rate of the nonstructural proteins ELISA antibodies of the highly purified vaccine group is significantly higher than that of averagely purified vaccine group.It is suggested that estimating the purity of the foot－and－mouth disease vaccine by means of the NSPs ELISA antibodies detected can be a method to control the qualities.

foot－and－mouth disease vaccine；nonstructural proteins；antibody；purity

2015－02－17

A

1002－1280（2015）04－0017－04

S858.2

趙麗霞，獸醫(yī)師，從事獸用生物制品質(zhì)量保障工作。E－mail：zhaolixia＠jinyubaoling.com.cn