參芪王漿養(yǎng)血口服液單糖成分高效液相指紋圖譜研究

陳志恒，馬晉芳，肖 雪,3，梁 潔，李莎莎

(1.濰坊市食品藥品檢驗檢測中心，山東 濰坊 261205；2.中山大學 南沙研究院，廣東 廣州 511458； 3.廣東藥學院，廣東 廣州 510006；4.廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510006)

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參芪王漿養(yǎng)血口服液單糖成分高效液相指紋圖譜研究

陳志恒1，馬晉芳2，肖 雪2,3，梁 潔3*，李莎莎4*

(1.濰坊市食品藥品檢驗檢測中心，山東 濰坊 261205；2.中山大學 南沙研究院，廣東 廣州 511458； 3.廣東藥學院，廣東 廣州 510006；4.廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510006)

目的：將參芪王漿養(yǎng)血口服液經3-甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮(PMP)試劑衍生化后，采用高效液相色譜法建立其單糖類成分的指紋圖譜，為該制劑的質量控制提供依據(jù)。方法：采用Phenomenex Luna RP C18(250mm×4.6mm，5 μm)色譜柱，流動相為0.1mol/L磷酸二氫鉀緩沖鹽(pH=6.7)(A)-乙腈(B)，梯度洗脫，流速為1.0mL/min，檢測波長為250nm。結果：建立了參芪王漿養(yǎng)血口服液中單糖類成分的HPLC指紋圖譜，以10個共有峰作為參照峰，采用指紋圖譜評價軟件計算相似度均≥0.85。結論：采用高效液相色譜法建立參芪王漿養(yǎng)血口服液單糖類成分的指紋圖譜可為該制劑的內在質量控制提供參考依據(jù)。

參芪王漿養(yǎng)血口服液；單糖；高效液相色譜法；指紋圖譜

參芪王漿養(yǎng)血口服液(Nourishing Oral Liuid of Royal Jelly, Ginseng and Astragalus Root)由人參、黃芪、當歸、蜂王漿等原料經現(xiàn)代生產工藝加工而成，主要功效為補益氣血、養(yǎng)心安神，可用于氣血兩虛證的治療，癥見神倦乏力、食欲不振、失眠等[1]。目前參芪王漿養(yǎng)血口服液執(zhí)行質量標準較低，不能有效控制產品質量。與傳統(tǒng)的檢測手段相比，指紋圖譜是國際公認的控制中藥質量最有效的方法之一，其可較為全面地反映多種成分在中藥中的含量分布情況[2-4]。在前期的研究基礎上[5-6]，本試驗進一步對衍生化后的參芪王漿養(yǎng)血口服液進行高效液相色譜(HPLC)分析，建立了該制劑中單糖類成分的HPLC指紋圖譜，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UltiMate 3000高效液相色譜儀，包括梯度泵SR-3000，自動進樣器WPS-3000，柱恒溫系統(tǒng)TCC-3000，紫外檢測器DAD-3000，色譜工作站變色龍7.2(美國Thermo公司)；XS-205 DualRange型十萬分之一分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。

1.2 試藥

乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司)，甲醇、磷酸二氫鉀緩沖鹽、3-甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮(PMP)、鹽酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀均為分析純(廣州化工廠)，純化水自制。

參芪王漿養(yǎng)血口服液由吉林敖東延邊藥業(yè)股份有限公司提供。

2 方法與結果

2.1 PMP甲醇溶液配制

稱取21.775g PMP于250mL容量瓶中，采用甲醇溶解并定容至刻度，以超聲助溶。

2.2 色譜條件

色譜柱為Phenomenex Luna RP C18(250mm×4.6mm，5μm)，流動相為0.1mol/L磷酸二氫鉀緩沖鹽(pH=6.7)(A)-乙腈(B)，梯度洗脫，流速為1.0mL/min，柱溫為30℃，檢測波長為250nm。見表1。

表1 流動相洗脫程序

2.3 樣品供試品制備

精密量取參芪王漿養(yǎng)血口服液1mL于100mL容量瓶中，用純化水定容至刻度，以0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.4 樣品衍生化

精密吸取參芪王漿養(yǎng)血口服液稀釋品溶液200μL 2份于具塞離心管中，分別編號為樣品1、樣品2，加入0.3mol/L NaOH 200μL，充分混勻，后加0.5mol/L PMP甲醇溶液160μL，混勻后置于70℃水浴加熱30min，取出放冷，再加0.3mol/L HCl 200μL中和堿液，加純化水1 240μL、氯仿2mL，搖勻，3 500轉/min離心5min，棄去氯仿層。重復萃取3次，水層過0.45μm濾膜，收集濾液注入HPLC。分別取5μL各供試品溶液衍生化后，注入HPLC儀進行測定。見圖1。

圖1 參芪王漿養(yǎng)血口服液中單糖衍生化后的色譜

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗 取批號為“1202001”的參芪王漿養(yǎng)血口服液成品，按照“2.3”項下方法制備樣品溶液，按照“2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄指紋圖譜，以9號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果表明，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別小于1.0%和3.0%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復性試驗 取批號為“1202001”的參芪王漿養(yǎng)血口服液成品6支，按照“2.3”項下方法制備樣品溶液，按照“2.2”項下色譜條件分別進樣測定，記錄指紋圖譜，以9號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果表明，各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD分別小于1.0%和3.0%，表明該方法重復性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 取批號為“1202001”的參芪王漿養(yǎng)血口服液成品，按照“2.3”項下方法制備樣品溶液，按照“2.2”項下色譜條件，分別于0、2、4、8、16、24h進樣測定，記錄指紋圖譜。以9號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果表明，各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD均小于3.0%，表明樣品溶液在24h內性質穩(wěn)定。

2.6 參芪王漿養(yǎng)血口服液指紋圖譜相似度研究[7-9]

分別精密量取多批供試品溶液各5μL，按照“2.2”項下色譜條件進樣，記錄指紋圖譜，通過指紋圖譜評價軟件(中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，2004A版)分析，以10個共有峰為參照峰。將實驗數(shù)據(jù)導入指紋圖譜相似度評價軟件，經自動匹配，生成對照指紋圖譜(S)，見圖2。各樣品與對照色譜圖進行比較，采用夾角余弦法計算相似度，進行整體相似度評價。通過相似度分析，發(fā)現(xiàn)各批樣品的相似度均在0.85以上，樣品相似性良好。見表2。

圖2 參芪王漿養(yǎng)血口服液參照指紋圖譜

批號S1S2S3S4S5S6S7S8S9相似度0．8990．9990．9930．9940．9950．9940．9950．9940．995

3 討論

按照國家藥典委員會關于“中藥注射液指紋圖譜研究的技術要求(暫行)通知”，采用HPLC梯度洗脫法對參芪王漿養(yǎng)血口服液中的單糖類成分進行了指紋圖譜研究。實驗結果表明，該方法可操作性強、重復性好，可為參芪王漿養(yǎng)血口服液中單糖成分的研究提供參考依據(jù)。

本試驗考察了不同溫度下單糖指紋圖譜的分離度，發(fā)現(xiàn)25℃時指標峰分離度變差，35℃和40℃時基線漂移較為嚴重，而30℃時基線較為平穩(wěn)，分離度也較好。同時本試驗也考察了多個流速的指紋圖譜，流速為0.5mL/min和0.8mL/min時，色譜不能完全出峰；流速為1.2mL/min時，各指標峰的保留時間變小，分離度降低；當流速為1.0mL/min時，各色譜峰分離度較高，峰型較好，因此確定1.0mL/min為參芪王漿養(yǎng)血口服液單糖指紋圖譜的洗脫流速。

本研究采用衍生化法測定9批參芪王漿養(yǎng)血口服液中單糖成分的相似度，經指紋圖譜相似度軟件分析，其相似度均在0.85以上。本實驗所建立的方法精密度、穩(wěn)定性和重復性均符合指紋圖譜的技術要求，可基于此對參芪王漿養(yǎng)血口服液中的單糖類成分進行HPLC-IT-MS和HPLC-TOF-MS分析，為參芪王漿養(yǎng)血口服液的質量控制提供更多參考依據(jù)。

[1] 金光日,洪海.參芪王漿養(yǎng)血口服液中10-羥基-2-癸烯酸(10-HAD)的含量測定[J].長春中醫(yī)藥大學學報,2007,23(5):32-33.

[2] 羅國安,梁瓊麟,王義明.中藥指紋圖譜-質量控制與新藥研發(fā)[M].北京:化學工業(yè)出版社,2009.

[3] 肖雪,羅國安,王義明,等.中藥板藍根高效液相色譜法指紋圖譜研究[J].江西中醫(yī)學院學報,2010,22(3):67-69.

[4] 羅娟敏,肖雪,梁瓊麟,等.丹紅注射液指紋圖譜研究[J].中成藥,2011,33(8): 1277-1290.

[5] 祖雙,梁潔,劉明穎,等.參芪王漿養(yǎng)血口服液高效液相指紋圖譜研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2015,11(2):19-21.

[6] 祖雙,劉黎鋒,梁潔,等.兩種相似度表征參芪王漿養(yǎng)血口服液指紋圖譜質量研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2015,11(3):30-31.

[7] 喬善磊.中藥指紋圖譜相似度評價研究[D].上海:第二軍醫(yī)大學,2004：5.

[8] 曹進,饒毅,沈群,等.中藥指紋圖譜及其建立原則[J].中藥新藥與臨床藥理,2001,12(3):200-203.

[9] 聶磊,曹進,羅國安,等.中藥指紋圖譜相似度評價方法的比較[J].中成藥,2005,27(3):249-252.

(責任編輯：尹晨茹)

Fingerprints of Monosaccharides in Nourishing Oral Liuid of Royal Jelly, Ginseng and Astragalus Root by HPLC

Chen Zhiheng1,Ma Jinfang2,Xiao Xue2,3,Liang Jie3*,Li Shasha4*

(1.Weifang Center for Food and Drug Control, Weifang 261205,China;2.Nansha Research Institute, Sun Yat-sen University,Guangzhou 511458, China;3.Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China;4.Guangzhou Province Hospital of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China)

Objective:To study the HPLC fingerprint and to establish a sensitive and specific method for controlling the quality of Monosaccharides in Nourishing Oral Liuid of Royal Jelly, Ginseng and Astragalus Root (NOLRJGA) derived by PMP reagent.Methods:HPLC method was set up, using Phenomenex Luna RP C18(250mm×4.6mm,5μm)with gradient elution, and the mobile phase was comprised of potassium dihydrogen phosphate-buffered saline(0.1mol/L,pH=6.7) and Acetonitrile, the UV detection wavelength was at 250nm, with a flow rate of 1.0 mL/min.Results:The HPLC fingerprint was set up, and the similarity were higher than 0.85 with a total of 10 peaks as reference peaks by similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of TCM.Conclusion:The quality of Monosaccharides in NOLRJGA can be controlled effectively by HPLC fingerprints.

Nourishing Oral Liuid of Royal Jelly;Ginseng and Astragalus Root; Monosaccharide;HPLC;Fingerprint

2015-04-16

陳志恒(1983-)，女，山東省濰坊市食品藥品檢驗檢測中心藥師，研究方向為中藥制劑分析。

李莎莎(1983-)，女，廣東省中醫(yī)院助理研究員，研究方向為中藥質量控制。梁潔(1969-)，女，廣東藥學院副教授，研究方向為食品安全與中藥質量控制。E-mail：liangjie69@126.com

R284.1

A

1673-2197(2015)22-0025-03

10.11954/ytctyy.201522010