液氨預(yù)處理(LAT)促進(jìn)玉米秸稈的高效酶解糖化

劉建軍 ，邵千鈞 ，吳 龍 ，晉芳偉

（1.三明學(xué)院 機(jī)電工程學(xué)院，福建 三明 365004;2.機(jī)械現(xiàn)代設(shè)計(jì)制造技術(shù)福建省高校工程研究中心,福建 三明 365004;3.福建三明高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)博士后工作站，福建 三明 365004;4.機(jī)械工程福建省重點(diǎn)學(xué)科,福建 三明 365004；5.綠色鑄鍛及其高端零部件制造協(xié)同創(chuàng)新中心,福建 三明 365004；6.福建省高端鑄鍛零部件制造工程技術(shù)研究中心,福建 三明 365004；7.寧波大學(xué)，浙江 寧波，315211）

纖維素乙醇被稱為第二代生物燃料技術(shù)，它以木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)為原料，而農(nóng)作物秸稈是該類生物質(zhì)的重要來(lái)源之一。我國(guó)年產(chǎn)秸稈6.98億t，其中玉米秸稈1.71億t，約占秸稈總量的1/4[1]，目前秸稈的利用率偏低。預(yù)處理、酶解、發(fā)酵是纖維素乙醇煉制過(guò)程中的3個(gè)關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，預(yù)處理是克服木質(zhì)纖維素原料的酶解頑抗性的必要手段[2－3]。預(yù)處理方法主要有：酸法、堿法、水熱法、蒸汽爆破法和氨纖維爆破法等[4－5]。預(yù)處理效果通過(guò)酶解率、預(yù)處理成本、是否產(chǎn)生毒害酶解或發(fā)酵的抑制劑、環(huán)境危害等因素來(lái)判斷。我國(guó)學(xué)者圍繞纖維素乙醇研究對(duì)玉米秸稈采用了酸法[6]、堿法[7]、水熱法、汽爆法[8]、微波與酸化汽爆[9]等多種預(yù)處理方式，進(jìn)行了預(yù)處理和酶解的相關(guān)試驗(yàn)研究，纖維素與半纖維素的72 h酶解率分別在80%和60%左右。國(guó)外學(xué)者圍繞玉米秸稈的預(yù)處理與酶解糖化的研究更為細(xì)致而全面[4－5]，并重視預(yù)處理過(guò)程中的物理化學(xué)變化、木質(zhì)素移除與轉(zhuǎn)化等促進(jìn)酶解的機(jī)理方面的研究[10－12]。

對(duì)比預(yù)處理研究文獻(xiàn)，以氨為介質(zhì)的預(yù)處理方法對(duì)于玉米秸稈具有較好的預(yù)處理效果。氨是一種價(jià)格低廉的堿性原料，其水溶液或純液氨可用于預(yù)處理。氨水預(yù)處理主要代表方法是氨回收滲濾法（ammonia recycle percolation，ARP），又可根據(jù)處理溫度、氨含量與水分不同，細(xì)分為 ARP法[13]、SAA 法（soaking in aqueous ammonia）[14]和 LMAA 法（low－moisture anhydrous ammonia）[15]等，但它的處理周期長(zhǎng)，如ARP法長(zhǎng)達(dá)10～60 d。液氨主要用于氨爆法或氨纖維膨脹法（ammonia fiber expansion，AFEX），處理后的玉米秸稈在添加纖維素酶15 FPU/（g葡聚糖）時(shí)168 h的葡聚糖和木聚糖的酶解率達(dá)到95%和80%以上[16]，酶解效果非常好。

本研究在AFEX的基礎(chǔ)上提出了LAT法，采用液氨加溫處理，預(yù)處理溫度范圍加大，但不采用快速釋放氨氣的爆破法。AFEX過(guò)程基本上不產(chǎn)生酶解與發(fā)酵抑制劑和環(huán)境危害物[16]，本實(shí)驗(yàn)與之相近。因此對(duì)LAT預(yù)處理后玉米秸稈的酶解效果與酸、堿、熱水、汽爆、AFEX等預(yù)處理方法進(jìn)行了對(duì)比。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

玉米秸稈（糯玉米）采自福建省三明市（東經(jīng)117.35°、北緯26.13°），采收期為7月份（播種至青穗采收約65 d）。實(shí)驗(yàn)采用地上部分的整株植物，將其切割成約1～2 cm長(zhǎng)條狀，初曬后經(jīng)40℃烘干至含水率低于15%，用FZ102微型植物粉碎機(jī)粉碎成50～100目粉末。經(jīng)混合均勻后采用水分分析儀MA35（賽多利斯）測(cè)得其含水率，并用塑料袋密封后置－20℃冰箱中存放備用。

用于高效液相色譜（HPLC）分析的對(duì)照品的葡萄糖、木糖等均采購(gòu)自Sigma－Aldrich公司，純度為99%以上；預(yù)處理用的氨采購(gòu)自杭州龍山化工有限公司。

添加的水解酶為纖維素酶 (novozyme NS50013)、β－葡萄糖苷酶 （novozyme NS50010)，由諾維信（中國(guó)）有限公司提供。NS50013纖維素酶的活性由濾紙法測(cè)定，它是一種混合酶，具有木聚糖酶活性，故實(shí)驗(yàn)中未添加木聚糖酶。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)分析方法參照了美國(guó)國(guó)家可再生能源實(shí)驗(yàn)室（National Renewable Energy Laboratory，NREL）制定的實(shí)驗(yàn)規(guī)程（Laboratory Analytical Procedure，LAP）[17]，并減少了酶制劑的添加量（由60 FPU/(g葡聚糖)改為15 FPU/(g葡聚糖)），加大了反應(yīng)容量（由原規(guī)程中的10 mL增加為15 mL）。

1.2.1 組分測(cè)定

玉米秸稈中碳水化合物和酸不溶性木質(zhì)素（Klason木質(zhì)素）采用酸水解法測(cè)定，碳水化合物組分由LAP002方法測(cè)定，酸不溶性木質(zhì)素由LAP003方法測(cè)定。LAP002和LAP003采用二步酸解法，在一次實(shí)驗(yàn)中完成。

酸水解的具體步驟是先用分析天平稱量已知含水率并去除抽提物的秸稈原料約0.3 g，加入72%硫酸3 mL，在30℃水浴中保持2 h，加去離子水84 mL（稀釋至4%硫酸），放入滅菌鍋中121℃保持1 h。經(jīng)真空過(guò)濾后將濾紙上的固形物烘干至恒重，用HPLC法（色譜分析柱采用BioRad醇酸柱HPX-87H）測(cè)定各種單糖的含量，并折算成葡聚糖(纖維素)、木聚糖、阿拉伯聚糖等比例，由濾紙上的固形物質(zhì)量與灰分測(cè)定來(lái)確定不溶性木質(zhì)素含量。

灰分測(cè)定采用LAP005規(guī)程，用分析天平稱量1 g左右已知含水率的原料，將其放入已測(cè)定質(zhì)量的有蓋陶瓷坩鍋中，置入箱式電阻爐中程序緩慢升溫，約2 h后升至575℃，保持此溫度4 h以上。冷至105℃時(shí)將坩鍋取出放入干燥器，冷卻后稱量質(zhì)量并計(jì)算灰分。

1.2.2 液氨預(yù)處理（LAT法）

LAT法預(yù)處理：根據(jù)原料確定反應(yīng)用量，將確定量的液氨注入移液鋼瓶（300 mL），并加熱小鋼瓶至50℃左右；將待處理的已知含水率的原料放置在反應(yīng)器（改裝的高壓反應(yīng)釜，大連自控設(shè)備廠）中，并將反應(yīng)器抽成真空；然后將氨注入反應(yīng)器，加熱反應(yīng)器到預(yù)定溫度；在預(yù)定溫度下駐留一定的時(shí)間，而后氨被釋放（約30 s），即預(yù)處理過(guò)程完成。取出處理原料置于通風(fēng)柜中讓處理后原料中的氨逸出，然后在烘箱中低于40℃干燥。稱重并測(cè)得含水率，計(jì)算預(yù)處理后生物質(zhì)原料得率，將處理后的原料放入－20℃冰箱冷藏備用。

LAT預(yù)處理優(yōu)化的工藝參數(shù)選擇分別為：預(yù)處理的溫度、含水率、駐留時(shí)間等，另外氨用量也可以作為參數(shù)供優(yōu)化。

1.2.3 酶水解

酶水解參照LAP009的相關(guān)規(guī)程進(jìn)行，酶解液總量為15 mL，每組樣品酶解至少做一組重復(fù)。根據(jù)規(guī)程，酶解采用1%葡聚糖當(dāng)量，即稱取0.15 g葡聚糖當(dāng)量的秸稈放入酶解瓶（20 mL樣品瓶），依次加入蒸餾水、檸檬酸鈉緩沖溶液（平衡后pH值為4.8）、抗生素（四環(huán)素和環(huán)己酰亞胺），經(jīng)預(yù)混合1h后添加纖維素酶、β-葡萄糖苷酶。每克葡聚糖當(dāng)量的生物質(zhì)原料中添加纖維素酶15 FPU/（g葡聚糖）、β-葡萄糖苷酶64 pNPGU/（g葡聚糖）。酶解條件是溫度設(shè)定為50℃，搖床轉(zhuǎn)速為150 r·min-1。酶解取樣時(shí)間分別為24、72 h。

酶解取樣1 mL放入離心管，放置加熱器（設(shè)置溫度99℃）中加熱20 min，使酶蛋白變性失效，放入－20℃冰箱冷卻5 min，再放入離心機(jī)（艾本德 5424，設(shè)置轉(zhuǎn)速 14500 r·min-1）離心 5 min，經(jīng) 0.22 μm一次性針頭過(guò)濾器過(guò)濾（聚醚砜膜）后轉(zhuǎn)入HPLC分析瓶，放入4℃或－20℃冰箱冷藏待分析。

1.2.4 單糖的測(cè)定

酸解或酶解液中糖的定量分析用HPLC法，設(shè)備為帶示差檢測(cè)器的Agilent Technologies 1200系列色譜儀。采用BioRad公司的HPX-87H色譜柱（該色譜柱可適用于中性或酸性溶液），流動(dòng)相為0.005 mol·L-1稀硫酸，流速為 0.60 mL·min-1，柱溫為 50 ℃。

1.2.5 酶解率計(jì)算

酶解轉(zhuǎn)化率（酶解率）為實(shí)際獲得單糖含量與理論最高可得單糖含量之比，而理論最高可得單糖根據(jù)原料中經(jīng)組分分析（二步酸解法，LAP002）的聚糖含量進(jìn)行折算。以葡聚糖的酶解率為例，其計(jì)算公式是：

酶解率d為百分?jǐn)?shù)，式中分子為酶解所獲得葡萄糖含量折算成葡聚糖的量，其中g(shù)為酶解液中葡萄糖的含量 （單位為g/L），15為酶解液的體積，162/180為化學(xué)式中葡萄糖因聚合失去一個(gè)水分子的比例;分母為理論上加入的葡聚糖量，b為加入的原料干基質(zhì)量，c為組分分析（酸解法）葡聚糖含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 原料成分分析

原材料的組分如表1所示，碳水化合物和木質(zhì)素含量通過(guò)二步酸解法分析獲得，灰分通過(guò)箱式電阻爐加熱分析獲得。秸稈中葡聚糖（纖維素）和木聚糖的含量合計(jì)為56.21%，這是理論上可以轉(zhuǎn)化為單糖的聚糖主要來(lái)源。

表1 玉米秸稈的組分分析（干基）

2.2 預(yù)處理溫度對(duì)酶解效果的影響

預(yù)處理溫度對(duì)酶解率的影響如圖1所示，橫坐標(biāo)為預(yù)處理溫度，即預(yù)處理加熱到此溫度下并保留一定時(shí)間的溫度（實(shí)驗(yàn)過(guò)程中溫度波動(dòng)范圍為±5℃）；葡聚糖/木聚糖的轉(zhuǎn)化率用柱狀圖表示（左側(cè)縱坐標(biāo)），每千克干基秸稈原料獲得的單糖量為點(diǎn)線圖（右側(cè)縱坐標(biāo)）。本實(shí)驗(yàn)固定液氨與原材料(干基)質(zhì)量比為1∶1,其他預(yù)處理?xiàng)l件預(yù)設(shè)為含水率60%、預(yù)處理駐留時(shí)間為5 min。在70℃～130℃范圍內(nèi)，葡聚糖酶解率的總體變化趨勢(shì)是隨著溫度升高而增加，在90℃后，提升更趨緩慢；木聚糖酶解率在90℃有較大值，110℃有所下降，130℃又有提升。單糖總體得率隨著溫度升溫而略有上升，90℃時(shí)葡聚糖和木聚糖的轉(zhuǎn)化率分別為86.0%和79.2%，每千克干基秸稈可得單糖524.7 g，轉(zhuǎn)化率約為理論最高轉(zhuǎn)化率的83.3%；130℃時(shí)葡聚糖和木聚糖的轉(zhuǎn)化率分別為91.8%和82.1%，可得單糖554.4 g，轉(zhuǎn)化率約為理論量高轉(zhuǎn)化率的88.0%。

圖1 LAT預(yù)處理溫度對(duì)玉米秸稈葡聚糖和木聚糖的酶解率的影響

LAT預(yù)處理的優(yōu)化溫度略高于AFEX預(yù)處理，AFEX預(yù)處理用于玉米秸稈的優(yōu)化溫度為90℃[16]，而LAT預(yù)處理在90～130℃均具有較好的效果。LAT預(yù)處理后的酶解率與AFEX相當(dāng)，AFEX在優(yōu)化條件下，添加纖維素酶15 FPU/（g葡聚糖）的72 h葡聚糖和木聚糖的酶解率分別為接近90%和70%[18]，本研究中的130℃預(yù)處理后的酶解效果優(yōu)于AFEX。

2.3 預(yù)處理含水率對(duì)酶解效果的影響

預(yù)處理含水率是指預(yù)處理前物料的含水率，采用的是水分與干基物料的比例（此處為干基水分含水率），含水率對(duì)玉米秸稈葡聚糖和木聚糖的酶解率的影響如圖2所示。實(shí)驗(yàn)中含水率分別采用20%、40%、60%、80%，其他反應(yīng)條件為90℃、氨與秸稈質(zhì)量比為1∶1，反應(yīng)時(shí)間為5 min。在實(shí)驗(yàn)區(qū)間范圍內(nèi)，含水率在60%時(shí)具有最高的轉(zhuǎn)化率，此時(shí)葡聚糖和木聚糖72 h酶解率分別為85.97%和79.15%，每千克秸稈可得單糖524.7 g。

預(yù)處理前含水率的變化對(duì)酶解效果的影響與AFEX用于玉米秸稈的情形相近，為60%[18]；但與芒草等作物存在差異，芒在AFEX中最佳含水率出現(xiàn)在80%和200%[19]，LAT法在其他類生物質(zhì)原料中的應(yīng)用有待進(jìn)一步研究。

2.4 預(yù)處理駐留時(shí)間對(duì)酶解效果的影響

LAT預(yù)處理駐留時(shí)間對(duì)酶解效果的影響如圖3所示，實(shí)驗(yàn)駐留時(shí)間分別為3、5、10 min，其他條件為90℃、含水率60%、氨與原料比為1∶1。葡聚糖和木聚糖的轉(zhuǎn)化率在駐留時(shí)間3～10 min范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化率呈先上升后下降的趨勢(shì)，在駐留時(shí)間為5 min時(shí)達(dá)到峰值。隨著預(yù)處理時(shí)間加長(zhǎng)，可能是聚糖或單糖分解導(dǎo)致酶解率下降，其原因待進(jìn)一步分析。

圖2 預(yù)處理含水率對(duì)玉米秸稈葡聚糖和木聚糖的酶解率的影響

圖3 預(yù)處理駐留時(shí)間對(duì)玉米秸稈葡聚糖和木聚糖的酶解率的影響

2.5 質(zhì)量平衡

預(yù)處理與酶解的質(zhì)量平衡流程圖如圖4所示。采用的預(yù)處理?xiàng)l件為：預(yù)處理溫度130℃、含水率60%、駐留時(shí)間為5 min、液氨與生物質(zhì)比例為1∶1，纖維素酶添加量為15 FPU/（g葡聚糖），72 h葡聚糖和木聚糖的酶解率分別為91.8%和82.1%，1000 g干基玉米秸稈經(jīng)預(yù)處理后固體得率為95.35%，72 h酶解后可獲得單糖524.3 g（僅計(jì)算葡萄糖和木糖），而未作預(yù)處理的單糖獲得量為228.3 g，預(yù)處理后單糖得率是未處理原料的2.1倍。從質(zhì)量分析中可以看出，木糖在酶解轉(zhuǎn)化中占了相當(dāng)大的比例，約占總糖量的36%。如何使木糖在預(yù)處理過(guò)程中不被降解，并且在后續(xù)發(fā)酵過(guò)程中充分轉(zhuǎn)化為乙醇（采用基因工程改造的菌種），這在纖維素乙醇研究中非常重要。同時(shí)，質(zhì)量平衡在預(yù)處理方法對(duì)比過(guò)程中非常重要[20]，也值得研究者充分關(guān)注。

圖4 玉米秸稈LAT預(yù)處理與酶解過(guò)程質(zhì)量平衡流程圖

2.6 預(yù)處理效果比較

國(guó)外學(xué)者采用氨水預(yù)處理的ARP法和SAA（法，葡聚糖的15 FPU/（g葡聚糖）、72 h的酶解率分別為88.5%[13]和92.5%[14],LMAA法乙醇的理論得率為90%[15]。AFEX法預(yù)處理用于玉米秸稈的酶解率比較高，一般在90%左右[16，18]。LAT和AFEX法由于采用的是液氨，未參與反應(yīng)的氨可以再利用或回收，有利于降低成本和環(huán)境保護(hù)。

不同的預(yù)處理方法用于玉米秸稈，酶解效果存在較大的差異。如酸預(yù)處理，采用乳酸或乙酸及混合預(yù)處理，這3種方法的葡聚糖的轉(zhuǎn)化率為83.92%～94.28%，木聚糖的轉(zhuǎn)化率58.78%～81.08%[21]；玉米秸稈經(jīng)1%稀硫酸溶液浸潤(rùn)后經(jīng)121℃處理60 min，72 h后原料的酶解率為62.5%（纖維素酶添加量6 FPU/（g葡聚糖））[6]。如堿預(yù)處理，預(yù)處理?xiàng)l件為1.5%NaOH，80℃下反應(yīng)1 h時(shí)，48 h纖維素酶解率71.29%，半纖維素酶解率78.85%，總糖得率比未處理樣品提高46.66%[7]。水熱法預(yù)處理后48 h酶解率為63.13%[8]；汽爆預(yù)處理后纖維素與半纖維素酶解率分別為81.5%和55.3%（纖維素酶添加量為10 FPU/（g葡聚糖），144 h酶解）[22]；采用微波和酸化汽爆的優(yōu)化條件下預(yù)處理，在添加纖維素酶12 FPU/（g葡聚糖）時(shí)，葡聚糖的轉(zhuǎn)化率分別為47.5%和62.5%[9]。LAT預(yù)處理在優(yōu)化條件下，葡聚糖與木聚糖的酶解率分別為91.8%和82.1%，與酸、堿、熱水、汽爆等預(yù)處理方式相比，酶解率相對(duì)較高。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)玉米秸稈的LAT預(yù)處理和酶解糖化過(guò)程的實(shí)驗(yàn)研究，有如下結(jié)論：

（1）LAT預(yù)處理能顯著提高玉米秸稈原料的酶解率，預(yù)處理原料經(jīng)酶解后的單糖產(chǎn)量是未經(jīng)預(yù)處理的2.1倍，LAT法預(yù)處理后的酶解率和單糖得率高于酸、堿、水熱和汽爆法等。

（2）LAT法預(yù)處理的優(yōu)化條件是預(yù)處理溫度為90～130℃、含水率為60%（干基）、預(yù)處理駐留時(shí)間為5 min。在此優(yōu)化條件下（130℃），在纖維素酶添加量為15 FPU/（g葡聚糖）時(shí)，玉米秸稈中的葡聚糖和木聚糖72 h酶解率分別為91.8%和82.1%，每kg干基秸稈可得單糖524.3 g。

（3）溫度、含水率和駐留時(shí)間都對(duì)預(yù)處理的效果有影響，而溫度的影響為最大。

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