甘草黃酮對氧化損傷小鼠體內(nèi)抗氧化作用的影響

劉俊峰 劉永宏 郭雪峰

(塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 新疆 阿拉爾 843300)

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甘草黃酮對氧化損傷小鼠體內(nèi)抗氧化作用的影響

劉俊峰 劉永宏 郭雪峰*

(塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 新疆 阿拉爾 843300)

研究甘草黃酮對酒精氧化損傷小鼠體內(nèi)MDA的含量及T-SOD的活力的影響；采用每天定時(shí)定量給小鼠灌胃不同濃度的甘草黃酮來研究甘草黃酮對氧化損傷小鼠體內(nèi)MDA、T-SOD活力的影響。采用健康且體重相近的60只小白鼠，平均體重18±2 g，隨機(jī)分為6組，每組10只。實(shí)驗(yàn)全期自由飲水，在第42d，分別取血清、肝臟和腦組織。實(shí)驗(yàn)測定對照組和實(shí)驗(yàn)組的小白鼠血清中的MDA的含量和T-SOD的活性。結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)組的T-SOD的活性顯著高于對照組(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組的MDA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與對照組相比差異顯著(P<0.05)。

甘草黃酮； 丙二醛； 總超氧化歧化酶

甘草多生長在干旱、半干旱的荒漠草原、沙漠邊緣和黃土丘陵地帶。研究表明，甘草抑制引起糖尿病的醛糖還原酶和單胺氧化酶，鎮(zhèn)痛解痙、防治治療老年性骨質(zhì)疏松癥和病毒性肝炎、抗利什曼原蟲、抗艾滋病(AIDS)、抗癌等作用[1]。甘草提取物一般包含：甘草甜素、甘草酸，甘草苷、甘草類黃酮、后幕比檀素、刺芒柄花素、槲皮素等。為黃色至棕黃色粉末[2-3]。在新疆主要有烏拉爾甘草(G.uralensis Fisch)、脹果甘草(G.inflate Bat)和光果甘草(G.glabraL)。中國是世界上研究甘草最早的國家[4]，甘草中主要含有甘草酸、甘草次酸、黃酮、生物堿和氨基酸等成分[5]。近年來我國學(xué)者進(jìn)行了大量甘草提取物的化學(xué)成分的研究[6]。研究結(jié)果顯示，甘草黃酮具有起泡性和溶血作用很低、安全無毒和較強(qiáng)的醫(yī)療保健功效，顯著抑制脂質(zhì)體過氧化物的作用也廣泛被應(yīng)用[7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，廣泛使用的人工合成抗氧化劑對人體具有多種損害作用，使得天然抗氧化劑越來越多受到食品工作者的重視。甘草抗氧化劑就是其中之一。發(fā)現(xiàn)極性亞油酸甲酯中，甘草溶劑萃取物具有很好的抗氧化效果[11]。關(guān)于天然抗氧化劑的研究在國內(nèi)也有諸多的報(bào)道，在食品上主要應(yīng)用甘草黃酮成分作為天然抗氧化劑，但是，在動(dòng)物飼料添加劑上的研究較少，尤其甘草黃酮對酒精氧化損傷小鼠血清的抗氧化調(diào)控及作用報(bào)道較少。另外研究證明甘草黃酮能夠清除自由基能力較強(qiáng),對腦組織脂質(zhì)過氧化具有拮抗作用[12]。Fenton反應(yīng)生成的羥自由基，甘草總黃酮具明顯的直接清除作用,對于羥自由基的IC50清除能力是甘露醇的1/255,抑制羥自由基生成的IC50是甘露醇的1/139[13]。研究顯示，甘草黃酮類化合物對4種活性氧具有清除效應(yīng)[14],甘草黃酮可降低β-胡蘿卜素?fù)p耗,國外學(xué)者從抗低密度脂蛋白(LDL)氧化的角度闡明抗過敏、抗血栓、抗腫瘤、抗炎等作用之間的關(guān)系[15]。本研究主要了解甘草黃酮對小白鼠血液和組織中的丙二醛、超氧化物歧化酶抗氧化性能的影響，探索甘草黃酮作為伴侶動(dòng)物日糧添加劑的應(yīng)用前景提供必要的理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

實(shí)驗(yàn)小白鼠購買于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(清潔級)，平均體重18±2 g，隨機(jī)分為6組，每組10只。空白對照組：正常飼喂；模型組：每天給予同等體積的生理鹽水并每只每天頸背部皮下注射D-半乳糖400 mg/kg·bw；其余各組小鼠每只每天頸背部皮下注射D-半乳糖400 mg/kg·bw；同時(shí)，每天灌喂，維生素C組：100 mg/kg·d；甘草黃酮高劑量組：150 mg/kg·d；甘草黃酮中劑量組：100 mg/kg·d；甘草黃酮低劑量組：40 mg/kg·d；每組10只重復(fù)，實(shí)驗(yàn)期42 d。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的劑量與飼養(yǎng)管理

甘草黃酮在基礎(chǔ)日糧除外還要灌服的劑量為：低劑量組40 mg/kg·d，中劑量組100 mg/kg·d，高劑量組150 mg/kg·d。每天一次灌胃，定時(shí)定點(diǎn)。每天飼喂時(shí)觀察記錄每組小鼠的精神狀況、死亡及小鼠更換情況等一系列變化。實(shí)驗(yàn)第42 d時(shí)，取材包括采血和取樣。取材：全腦、肝臟、→生理鹽水沖洗2次→濾紙吸干→稱重→浸入甲醛液中。采血：每只斷頭采血1～1.5mL，裝入抗凝采血管(禁止搖晃)。3 500 r/min離心10 min取血清，-20 ℃低溫保存。于南京建成科技有限公司購置實(shí)驗(yàn)試劑盒。應(yīng)用T6-新世紀(jì)分光光度計(jì)測定所有吸光度指標(biāo)。

1.3 組織樣本的前處理

將各組織塊剪碎倒入玻璃勻漿管中，再將剩下的1/3勻漿介質(zhì)沖洗殘余在小燒杯中的碎組織，然后一起倒入玻璃勻漿管中進(jìn)行勻漿，將勻漿管下端插入盛有冰水的器皿中，轉(zhuǎn)動(dòng)研磨數(shù)十次，充分磨碎組織塊。

1.4 小白鼠血漿與組織中MDA 和T-SOD測定

1.4.1 儀器設(shè)備

550 nm分光光度計(jì)、37 ℃恒溫水浴箱、旋渦混勻器、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、量筒150 mL 1個(gè)、燒杯100 mL 、20 mL各1個(gè)、燒杯50 mL 6個(gè)、燒杯10 mL 3個(gè)、試管 40個(gè)、離心管 9個(gè)。

1.4.2 測定方法

根據(jù)試劑盒說明書操作方法進(jìn)行，血清取20 μL；肝組織取1%組織勻漿10 μL、腦組織取1%組織勻漿30 μL?；旌暇鶆?室溫下放置10分鐘，設(shè)定分光度計(jì)波長為550 nm處，選用1 cm光徑比色杯，用蒸餾水調(diào)零。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和SPSS13.0軟件中的平衡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析過程(ANOVA)，多重比較采用Duncan法進(jìn)行。應(yīng)用t檢驗(yàn)分析兩組間均值差異，測定值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳取樣量的確定

表1 最佳取樣量結(jié)果

最佳取樣量=(對照管吸光度-測定管吸光度)/ 對照管吸光度×100%；最佳取樣量取百分抑制率在48%～55%之間。最佳取樣濃度用黑體字表示。本實(shí)驗(yàn)血漿的最佳取樣量為20 μL；測定得出肝組織勻漿最佳取樣量為10 μL；腦組織勻漿的最佳取樣量為30 μL。另外測定的結(jié)果表明：血漿、肝組織、腦組織的百分抑制率分別為53. 14%、 48. 97%、 53. 12%。

2.2 甘草黃酮對小鼠體內(nèi)T-SOD活力的影響

表2 小鼠體內(nèi)T-SOD活力的測定結(jié)果(±S)( n=10)(U·ml-1)

注：*表示與對照組和模型組比較差異顯著P<0. 05；△表示甘草黃酮模型、低、中、高劑量組間比較差異顯著P<0. 05。

根據(jù)表2分析得出：血漿組、肝組織組、腦組織組中實(shí)驗(yàn)對照組、Vc組和空白對照組相比，實(shí)驗(yàn)對照組活力有所下降，Vc組變化不明顯。原因是D-半乳糖作用使小鼠體內(nèi)產(chǎn)生氧化損傷，抗氧化性降低，表現(xiàn)出SOD的活力降低。實(shí)驗(yàn)組和對照組、模型組結(jié)果相比較，SOD活力均有上升趨勢，劑量組和空白對照組、實(shí)驗(yàn)對照組之間差異顯著(P<0. 05)。說明甘草黃酮能提高小白鼠機(jī)體內(nèi)SOD活力。

SOD是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，現(xiàn)已證實(shí)多達(dá)60多種疾病是由氧自由基引發(fā)的。另外SOD能夠?qū)古c阻斷氧自由基對細(xì)胞損害，并及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞，同時(shí)SOD作為機(jī)體內(nèi)天然存在的超氧自由基清除因子可以把有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫。在血漿組、肝組織組、腦組織組的實(shí)驗(yàn)組與模型組比較差異顯著(P<0. 05)。實(shí)驗(yàn)組超氧化物歧化酶活力升高。甘草黃酮的低、中、高劑量組間比較，三個(gè)高劑量組的SOD活力均有上升趨勢。說明甘草黃酮的濃度越高對小白鼠超氧化物歧化酶活力的提高作用越大。肝組織、腦組織(P<0. 05)，三者差異顯著。且肝組織組的高劑量組的SOD活力上升趨勢最大，其次是腦組織。表明甘草黃酮能夠提高氧化損傷的小鼠體內(nèi)SOD的活力。

2.2 甘草黃酮對小鼠體內(nèi)MDA含量的影響

表3 小鼠體內(nèi)MDA含量的測定結(jié)果(±S)( n=10) (U·ml-1)

注：*表示與對照組、模型比較差異顯著，P<0. 05；**表示與對照組比較差異極顯著P<0. 01；△表示實(shí)驗(yàn)對照組、低、中、高劑量組間比較P<0. 05，差異顯著。

根據(jù)表3分析得出：血漿組、肝組織組、腦組織組中模型組、Vc組和對照組相比，模型組表現(xiàn)出上升趨勢，Vc組變化不明顯。小鼠機(jī)體中MDA的含量高低，可直接反映小鼠機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平，進(jìn)一步說明組織細(xì)胞損傷的程度。氧化損傷使小鼠體內(nèi)抗氧化性降低，從而機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度升高，則MDA的含量升高。也證明氧化損傷模型建立成功。實(shí)驗(yàn)組與對照組、模型組結(jié)果相比較，實(shí)驗(yàn)組的MDA活力含量均有下降，并且血漿組和肝組織組兩者差異極顯著(P<0. 01)，腦組織組差異顯著(P<0. 05)。說明甘草黃酮對小白鼠血漿中MDA具有抑制作用。本研究血漿組、肝組織組、腦組織組的甘草黃酮的模型組與實(shí)驗(yàn)組中低、中、高劑量組間比較(P<0. 05)，表明實(shí)驗(yàn)對照組與劑量組差異顯著。低、中、高三組實(shí)驗(yàn)組的MDA含量與對照組相比較均有所下降，且差異顯著(P<0. 05)，切高劑量組MDA含量下降更明顯，說明甘草黃酮的濃度越高，對小白鼠血漿中的MDA的含量的抑制作用越明顯，但腦組織的高劑量組表現(xiàn)出的卻是MDA的含量較中劑量組有所上升。說明甘草黃酮會(huì)抑制氧化損傷的小鼠體內(nèi)的MDA含量，此作用對肝組織較明顯，其次是腦組織。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過對生長良好、健康的小鼠飼喂甘草黃酮后的血漿、肝組織、腦組織抗氧化指標(biāo)的測定，結(jié)果表明：

3.1 劑量組較空白對照組、實(shí)驗(yàn)對照組、Vc組的氧化損傷的小鼠體內(nèi)的MDA含量有降低趨勢且趨勢明顯，表明甘草黃酮對機(jī)體中MDA有抑制作用，抑制作用極顯著(P<0. 01)。低、中、高劑量組差異明顯(P<0. 05)，低、中、高劑量組中MDA含量下降幅度呈現(xiàn)逐漸增加趨勢，高劑量組下降幅度明顯大于低、中劑量組。但對腦組織，甘草黃酮的劑量不宜過大，確定在以固定值即可，因?yàn)閯┝吭酱?，反而?huì)削弱甘草黃酮對MDA含量的抑制作用。

3.2 實(shí)驗(yàn)組較空白對照組、實(shí)驗(yàn)對照組、Vc組的氧化損傷的小鼠體內(nèi)的T-SOD的活力有明顯的上升趨勢(P<0. 05)，表明甘草黃酮對機(jī)體中T-SOD活力具有提高作用。低、中、高劑量組中T-SOD的活力呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，且高劑量組的上升幅度明顯大于低、中劑量組，表明甘草黃酮的濃度越高對T-SOD的活力提高作用越大。

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Effects of Licorice Flavonoids on the Oxidative Damage Antioxidant Index of Body in Mice

Liu Junfeng Liu Yonghong Guo Xuefeng*

(College of Animnl Science,Tarim University/Key Laboratory of Tarim Husbandry Science and Technology, Xinjiang Production & Construction Group, Alar, Xinjiang 843300)

The study was the effects of licorice flavonoids on the MDA concentration and T - SOD vitality of rats by alcohol oxidation damage. The effects of licorice flavonoids on the MDA concentration and T - SOD vitality of rats by oxidation damage were studied by using rats that were intragastric dministration with different concentrations of licorice flavonoids on timing per day. The healthy 60 rats with similar weight that is 18 ±2 g averagely were randomly divided into 6 groups, each group were 10 rats. The rats were free drinking water during experimental period, and the serum, liver and brain tissue of the rats were collected respectively in 42d. The MDA concentration and T - SOD vitality of the serum were determined in both of the control group and experimental group. The results show that T - SOD vitality of the experimental group was significantly higher than the control group (P < 0.05), the mass fraction of MDA of the experimental group was significant difference compared with control group (P < 0.05).

Licorice flavonoids; MDA; Total superoxide dismutase

2014-9-6

塔里木大學(xué)校長基金(TDZKSS201305)

劉俊峰(1980-)，男，講師，碩士，主要研究方向?yàn)橹参锾崛∥锱c飼料添加劑。 E-mail：liujunfeng423@163.com

E-mail：gxfdky@126.com

1009-0568(2015)02-0018-05

S

ADOI：10.3969/j.issn.1009-0568.2015.02.004