基于熵權(quán)相似度計(jì)算法的“江梔子”指紋圖譜研究*

★ 吳璐 黎曉麗 劉婧 方建和 楊華生＊ (江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌330004)

梔子為茜草科植物梔子(Gardenia jasminoidesEllis.)的成熟果實(shí)，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為中國(guó)藥典［1］各版收載的品種，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒等功效。梔子為江西道地藥材，在我國(guó)應(yīng)用廣泛。近年來(lái)，指紋圖譜分析技術(shù)由于具有適合從整體上分析復(fù)雜化學(xué)物質(zhì)成分的特點(diǎn)，已被美國(guó)［2］、WHO［3］、歐盟［4］等國(guó)家和組織接受，并用來(lái)評(píng)價(jià)天然藥物質(zhì)量。目前相似度計(jì)算多采用相關(guān)系數(shù)法或夾角余弦法(相合系數(shù)法)。但這兩種方法計(jì)算所得的相似度只與各成分之間含量的比值相關(guān)，可能會(huì)因?yàn)椴煌煞趾康淖兓谏w了某些特征峰的個(gè)性信息，導(dǎo)致其對(duì)樣本的區(qū)分能力較弱?；谶@些缺陷，本研究對(duì)傳統(tǒng)的指紋圖譜建立方法進(jìn)行改進(jìn)，開(kāi)發(fā)了熵權(quán)法用于指紋圖譜相似度的計(jì)算，并在中藥“江梔子”上進(jìn)行了實(shí)際應(yīng)用，成功建立了基于熵權(quán)法的“江梔子”藥材指紋圖譜相似度分析方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，Agilent化學(xué)工作站(美國(guó));賽多利斯BS 110S型電子分析天平(北京賽多利斯公司)。KQ-250型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 梔子苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110749-201316)，梔子對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)120986-201309)。乙腈(色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。20批梔子藥材(編號(hào)1～20)產(chǎn)地均為江西，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)付小梅副教授鑒定為茜草科植物梔子(Gardenia jasminoidesEllis.)的成熟果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 利用信息熵改進(jìn)指紋圖譜相似度的計(jì)算方法

指紋圖譜的相似度計(jì)算一般采用相關(guān)系數(shù)(r)或相合系數(shù)法(ρ)，兩者能快速、較好地通過(guò)完整指紋圖譜或色譜峰面積(峰高)計(jì)算指紋圖譜的相似程度。其計(jì)算公式如下:

其中xi為某個(gè)樣品對(duì)應(yīng)保留時(shí)間下的峰面積或峰高，xj為n批樣品(n大于等于10)對(duì)應(yīng)保留時(shí)間下的平均峰面積或峰高，k=1-m，m表示色譜峰數(shù)。利用信息熵計(jì)算各色譜峰的權(quán)重因子，相關(guān)系數(shù)與相合系數(shù)得到優(yōu)化后的計(jì)算公式如下:

公式(6)其中Pij表示第j個(gè)樣品指紋圖譜在第i個(gè)共有峰總面積中的“概率”。

2.2 色譜條件 Kromasil色譜柱(4.6mm×250mm，5μm);乙腈(A)-水(B，含0.2%磷酸)為流動(dòng)相，梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?0～10min 6%A，18 min 12%A，22 min 16%A，28 min 20%A，40 min 20%A，60min 36%A，65 min 55%A;平衡時(shí)間10 min;流速為1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm，參比波長(zhǎng)為580nm;柱溫為30℃;進(jìn)樣量為5μL。

2.3 樣品的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 取梔子苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含梔子苷0.8mg的對(duì)照品溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 按照文獻(xiàn)方法，分別從溶劑、提取方法2方面考察供試品溶液制備方法。以梔子苷對(duì)照品的加樣回收率結(jié)果為參考，確定最優(yōu)制備條件:取本品粗粉約0.4g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25mL，稱定重量，超聲(300W，100Hz)提取30min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.4 指紋圖譜建立的方法學(xué)考察

2.4.1 儀器精密度試驗(yàn) 取對(duì)照藥材，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)下方法連續(xù)測(cè)定5次。所有共有峰(占總峰面積90%)的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD均分別小于2.5%，5個(gè)指紋圖譜相關(guān)系數(shù)均大于0.95，表明儀器穩(wěn)定，精密度良好。

2.4.2 方法重復(fù)性試驗(yàn) 取對(duì)照藥材，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液5份，按2.2項(xiàng)下方法測(cè)定。所有共有峰(占總峰面積90%)的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD均分別小于2.5%，5個(gè)指紋圖譜相關(guān)系數(shù)均大于0.95，表明方法的重復(fù)性良好。

2.4.3 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn) 取對(duì)照藥材，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)下方法分別在0、6、12、18、24h進(jìn)行測(cè)定，梔子苷色譜峰峰面積RSD均小于2.5%，同時(shí)指紋圖譜所有共有峰(占總峰面積90%)的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2.5%，指紋圖譜相關(guān)系數(shù)均大于0.95，表明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5 樣品指紋譜圖的建立 取對(duì)照藥材及20批藥材樣品，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，得到標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜和20批梔子藥材的指紋圖譜，如圖1～3所示。

圖1 對(duì)照品圖譜

圖2 對(duì)照藥材指紋圖譜

圖3 20批藥材指紋圖譜

2.5 基于熵權(quán)法的“江梔子”指紋圖譜相似度研究

根據(jù)分離度高、特征性強(qiáng)的原則，篩選出11個(gè)色譜峰，11個(gè)共有峰的最小分離度均大于1.5，梔子苷對(duì)照峰(7號(hào)峰)的理論塔板數(shù)大于3000。以梔子對(duì)照藥材的指紋圖譜為標(biāo)準(zhǔn)模式，以梔子苷為對(duì)照峰計(jì)算各峰的相對(duì)峰面積，以面積歸一化法計(jì)算各峰的相對(duì)百分含量，把信息熵引入了相似度算法確定各特征峰的權(quán)重(表1)，并計(jì)算出各樣品與江梔子標(biāo)準(zhǔn)模式的相似度(表2)。

表1 各特征峰的權(quán)重

表2 熵權(quán)法與傳統(tǒng)方法的相似度計(jì)算結(jié)果比較

由圖3與表1可知，加權(quán)的方法能夠較好地反映出各特征峰的重要程度，其中7號(hào)梔子苷峰因其在共有指紋峰中所占面積比例大，分散度小，其相對(duì)權(quán)重被大大降低，而2、6、8號(hào)峰因它們的分布較為分散，相對(duì)權(quán)重較大，反映了它們對(duì)整體判斷的重要性。以梔子對(duì)照藥材的指紋圖譜作為標(biāo)準(zhǔn)圖譜，20批樣品用傳統(tǒng)相似度計(jì)算法和熵權(quán)相似度計(jì)算法算得的相關(guān)系數(shù)與相合系數(shù)均在0.95以上，說(shuō)明江西產(chǎn)梔子藥材的化學(xué)組成一致性較好，質(zhì)量較穩(wěn)定，道地性強(qiáng)。

3 討論

本研究曾考察了甲醇、75%甲醇、乙醇、75%乙醇4種提取溶劑及不同提取時(shí)間的提取效果，結(jié)果75%甲醇超聲提取30min的提取效果最好。分別考察了甲醇-水及乙腈-水流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果表明乙腈-水系統(tǒng)分離效果較好，各峰的保留時(shí)間適中，分離度較好，且基線穩(wěn)定，有利于指紋圖譜的分析。

用傳統(tǒng)的相似度算法來(lái)進(jìn)行中藥材指紋圖譜分析時(shí)，當(dāng)某些成分較其它成分含量高很多，且批次之間變化不明顯時(shí)，人們往往忽略了指紋圖譜中那些低含量成分峰面積變化對(duì)指紋圖譜整體的影響，從而導(dǎo)致對(duì)藥材道地性的誤判，如何有效地反映各成分對(duì)指紋圖譜變化的影響程度，是解決問(wèn)題的關(guān)鍵。把信息熵加權(quán)的方法引入相似度算法中，獲得各色譜峰的權(quán)重，不僅可以直接采用所有色譜峰(或全譜)數(shù)據(jù)來(lái)計(jì)算，而且使所得的相似度更加客觀合理。本研究結(jié)果表明，利用熵權(quán)相似度計(jì)算法研究“江梔子”指紋圖譜、識(shí)別其道地性是可行的，本法為“江梔子”道地性識(shí)別提供了又一種科學(xué)的參考，擴(kuò)展了指紋圖譜的應(yīng)用領(lǐng)域。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典·一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:231.

［2］CDER.Guidance for industry botanical drug products［Z］.Rockville:FDA，2004.

［3］WHO.Guidelines for the Assessmen to fherbal medicines［Z］.Geneva:WHO，1991.

［4］HMPWP.Final proposals for Revision of the Note for Guidance on Quality of Herbal Remedies［Z］.London:EMEA，1998.

［5］吳璐，楊華生.基于信息熵理論的中藥提取工藝研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(9):29-31.

［6］邱菀華.管理決策與應(yīng)用熵學(xué)［M］.北京:機(jī)械工業(yè)出版社，2002:10.