女貞子對大鼠肝組織DAPK基因mRNA表達(dá)量的影響*

★ 嵇琴 朱衛(wèi)豐 張敏 孫振 章明 彭淑紅（.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌330004；.江西中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 南昌330004；3.江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論分化發(fā)展研究中心 南昌330004）

女貞子為木犀科植物女貞（Ligustum lucidum Ait）的干燥成熟果實(shí)。其性涼。《本草綱目》記載具有養(yǎng)陰氣，平肝火的作用。很多研究結(jié)果都表明寒涼藥能抑制能量代謝[1-3]。線粒體是機(jī)體能量代謝的主要部位，是能量ATP的生成、利用及產(chǎn)熱作用發(fā)揮的主要場所。死亡相關(guān)蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK）基因在線粒體中作為一種線粒體膜電位（Δψm）的傳感器存在，線粒體呼吸鏈抑制將導(dǎo)致膜電位減少，進(jìn)而誘導(dǎo)DAPK激活和DAPK脫磷酸化[4]。DAPK是1995年由Kimchi及其同事在研究功能性基因克隆中首先發(fā)現(xiàn)的[5]。近年來，很多學(xué)者對DAPK相關(guān)進(jìn)行了較廣泛的研究，但沒有取得突破性進(jìn)展。本課題旨在研究DAPK的mRNA表達(dá)情況，試探找出女貞子降低能量代謝的作用機(jī)制，從而更好指導(dǎo)中藥的臨床運(yùn)用，進(jìn)一步為藥性的科學(xué)評價奠定基礎(chǔ)，也可對疾病發(fā)生的可能性及危害做出預(yù)測，以作出早期的預(yù)防和指導(dǎo)治療。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑 女貞子購自江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司，產(chǎn)品批號均為：1307007，產(chǎn)于江西。經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)鄧可眾副教授鑒定。RNA保護(hù)液購自天根生化科技有限公司（批號：M1705）；RNA提取試劑盒購自Promega公司（批號：20130601）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司（批號：000096365）；熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司（批號：AK2901）。所用引物通過引物設(shè)計軟件oligo 6自行設(shè)計，序列如下：內(nèi)參基因β-actin參照GenBank基因序列（NM_031144）設(shè)計，上游引物5’CCCATCTATGAGGGTTACGC3’，下游引物5’TTTAATGTCACGCACGATTTC 3’。DAPK基因參照GenBank基因序列（XM_006253523.1）設(shè)計，上游引物：5’AAG ACT GCGGAA GGA CAC 3’，下游引物：5’TAA CAGCCC ACA CTTGAGAG 3’。均由上海生工合成。

1.2 藥物制備 藥物水提液由本實(shí)驗(yàn)室制備。取女貞子藥材1.2 kg加入10倍量水，浸泡60 min，于煎藥壺中煎藥60 min，倒出藥液，殘渣再加入8倍水，煎煮60 min。合并2次藥液，濾過、濃縮后制成含生藥量2.9 kg·L-1）（用藥前稀釋），-20℃放置備用。

1.3 動物 SD大鼠，雄性，200-250g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK（相）2011-0003。給予大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水。

1.4 儀器SpectraMax Plus384全波長酶標(biāo)儀、全自動樣品快速研磨儀（上海凈信科技，Tissuelyser-24）高速低溫離心機(jī)（德國SIGMA公司SIGMA3-18K）、熒光定量PCR儀（ABI stepone plus）、電熱恒溫水浴鍋、微量移液器（Eppendorf）、渦旋混勻器、千分之一電子秤。

1.5 動物分組與給藥 大鼠30只，隨機(jī)分為三組，即空白對照組、女貞子低劑量組、女貞子高劑量組，每組10只。各組動物適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后開始灌胃給藥，灌胃容積為10mL·kg-1，每日1次，共給藥30d。每天給藥劑量：女貞子低劑量2g生藥·kg-1，女貞子高劑量6g生藥·kg-1，空白組給予等容量的蒸餾水。

1.6 試驗(yàn)取材 第31天將大鼠麻醉，取出肝臟后迅速按照順序分成若干份，提RNA的組織裝入RNA保護(hù)液中，其余組織分別用錫箔紙包好，迅速放入液氮中，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 SYBR Green實(shí)時定量PCR檢測DAPK基因的表達(dá)[6]

1.7.1 mRNA提取及反轉(zhuǎn)錄 取肝臟組織約30～100mg按照Promega RNA提取試劑盒說明書步驟提取總RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，全波長酶標(biāo)儀測定RNA的純度和濃度。所提取的RNA-70℃儲存?zhèn)溆?。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行cDNA合成。

1.7.2 DAPK和β-actin擴(kuò)增效率的檢測 首先參照Kenneth的方法[1]，取一份反轉(zhuǎn)錄好的肝臟cDNA樣品，分別稀釋至100倍、50倍、20倍、10倍、5倍、2倍、1倍。測定每一個稀釋倍數(shù)下的ΔCT=（CT，target gene-CT，β-actin），然后這些數(shù)據(jù)經(jīng)過最小二乘法線性回歸分析。

1.7.3 DAPK mRNA的檢測 取待測樣品的cDNA，按照熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作。反應(yīng)總體積20μL，cDNA為1～2μg，上游引物終濃度為0.5 μM，下游引物終濃度為0.5μM。反應(yīng)條件為：95℃1 min，95℃15 s及60℃60 s，共40個循環(huán)。最后做溶解曲線，以確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。所有樣品均重復(fù)檢測3次，用2-ΔΔCT方法來表示所檢測樣品相對于作為參照因子樣品的目的基因的表達(dá)倍數(shù)。ΔΔCT=（CT，目的樣本target gene-CT，目的β-actin）-（CT，參照樣本target gene-CT，參照樣本β-actin）。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。資料經(jīng)過方差齊性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。藥物組與對照組間的差異比較用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果

對大鼠肝臟DAPK mRNA表達(dá)的影響，與空白組比較，女貞子低劑量組增加了6.4%，無明顯統(tǒng)計學(xué)意義；女貞子高劑量組增加了91.8%，達(dá)到了顯著水平（P<0.05）。

3 討論

本文選擇了寒性中藥女貞子研究其對肝臟DAPK基因mRNA表達(dá)量的影響。中藥給藥劑量均參考藥典劑量范圍，DAPK是鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)的絲氨酸/蘇氨酸激酶，檢測mRNA表達(dá)水平是判斷組織表達(dá)該基因水平的重要手段之一。mRNA是連接基因與表達(dá)產(chǎn)物的橋梁?；蚧罨闹苯咏Y(jié)果是mRNA轉(zhuǎn)錄增加，而蛋白質(zhì)的合成有賴于mRNA的翻譯，即一種蛋白質(zhì)分子表達(dá)的調(diào)控從大體上來講可分為轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平。本試驗(yàn)采用Real time-PCR方法分析了女貞子對肝臟組織中DAPK基因mRNA表達(dá)的影響。

線粒體呼吸鏈抑制劑和解偶聯(lián)劑可以減少線粒體膜電位導(dǎo)致DAPK脫磷酸化和激活，由于DAPK在線粒體中作為一種線粒體膜電位（Δψm）的傳感器存在，膜電位減少，DAPK被激活[4]，則其很有可能是通過調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的電位梯度差，從而影響氧化磷酸化過程。DAPK在正常生理?xiàng)l件下是不活躍的，在本試驗(yàn)中，寒性中藥不同劑量女貞不同程度的促進(jìn)了肝臟DAPK表達(dá)量，提示女貞可能通過不同程度的影響膜電位差而促進(jìn)了DAPK的表達(dá)，從而影響了氧化磷酸化而達(dá)到抑制能量代謝的作用，這與文獻(xiàn)報道寒性藥物長期給藥后動物產(chǎn)熱減少，體溫下降也是一致的[7]。

［1］黃麗萍，彭淑紅，蒙曉芳，等.6種寒性中藥對大鼠肝臟能量代謝的影響［J］.中國中藥雜志，2009，34（24）：3 255-3 258.

表1 女貞子對大鼠肝臟DAPK mRNA表達(dá)量的影響

［2］彭淑紅，黃麗萍，高小恒，等.寒性中藥對大鼠骨骼肌能量代謝相關(guān)因子的影響［J］.中國中藥雜志，2009，34（23）：3 064-3 067.

［3］丁安榮，李淑莉，王奇志.大黃、梔子對小鼠紅細(xì)胞膜Na~+、K~+-ATP酶活性的影響［J］.中國中藥雜志，1990，15（1）：52-57.

［4］Tiesong SS，Joseph J，Hillard CJ，et al.Death-associated protein kinase as a sensor of mitochondrial membrane potential：role of lysosomein mitochondrial toxin-induced cell death［J］.JBiol Chem，2005.280（41）：34 644-34 653.

［5］謝海，仇小強(qiáng)，余紅平，等.5-氮雜-2’-脫氧胞苷對人肝癌細(xì)胞株SMMC7721增殖及DAPKmRNA表達(dá)的影響［J］.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012，29（1）：13-16.

［6］Marcel Kramer，Oliver Backhaus，Philip Rosenstiel，et al.，Analysis of relative gene dosage and expression differences of the paralogs RABL2A and RABL2B by Pyrosequencin g［J］.Gene，2010，455（1-2）：1-7.

［7］陳小野，周永生，樊雅莉，等.大鼠虛寒證模型的研制［J］.中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報，2001，9（3）：29-33.