大柴胡湯對豚鼠膽囊黏蛋白分泌及其基因表達(dá)的影響*

★ 陳小菁 胡曉晴 許亞超 韋宇峰 鄭志祥 楊軍平 張元 (．江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院普外科 南昌0006;．江西中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院 南昌000;．江西中醫(yī)藥大學(xué)0級碩士研究生 南昌0006;．江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科 南昌0006)

膽石病的發(fā)病原因至今仍未完全闡明?，F(xiàn)已證實，膽汁成分的改變，致石膽汁的形成，是膽石病產(chǎn)生與發(fā)展的重要因素，目前發(fā)現(xiàn)的促成致石膽汁的核蛋白包括免疫球蛋白、黏蛋白等［1－2］。在膽石形成中，大量的黏蛋白分泌，增高了致石膽汁的黏滯度，有利于膽石的形成?？梢?，有效的降低膽汁中黏蛋白的含量，逆轉(zhuǎn)致石性病理膽汁是預(yù)防膽石生成及膽石復(fù)發(fā)的關(guān)鍵［3］。中醫(yī)藥是通過多靶點、多環(huán)節(jié)、多途徑來發(fā)揮防治膽石病的作用。本研究通過隨機(jī)對照動物實驗，探討大柴胡湯對豚鼠膽囊壁黏膜細(xì)胞分泌黏蛋白、膽固醇及膽汁酸的影響，以及是否調(diào)節(jié)黏蛋白基因的表達(dá)。

1 材料與方法

1．1 藥品 大柴胡湯(柴胡15g、黃芩9g、芍藥9g、半夏9g、生姜15g、枳實9g、大棗5枚、大黃6g)，常規(guī)水煎，分別濃縮成含生藥量0．6g/mL、1．2g/mL、2．4g/mL三種劑量，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。熊去氧膽酸片，上海中西三維藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號:H37020552;膽固醇，1kg/袋，南昌賽爾(長城生物)有限公司生產(chǎn)，批號:20150118;魚肝油，500mL/瓶，廈門星鯊藥業(yè)集團(tuán)生產(chǎn)，批號:閩飼預(yù)字(2010)035015;總膽固醇試劑盒，上?？迫A東菱診斷用品有限公司生產(chǎn)，批號:20150213;Rat TBA Elisa Kit，美國進(jìn)口，批號:201503;生理鹽水，河南太龍藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號:1105045。

1．2 動物 健康SPF級雄性豚鼠60只，體重180～220g，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供，合格證號:SCXK(湘)2011－0003。

1．3 儀器 DY89－1型電動玻璃勻漿機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn);可調(diào)式移液器，上海雷勃分析儀器有限公司生產(chǎn);TGL－16G高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn);BIO－RAD－680型酶標(biāo)儀，美國BIO－RAD公司生產(chǎn);BTS－100型全自動生化儀，淄博恒拓分析儀器有限公司生產(chǎn);UV1000型紫外/可見分光光度計，上海天美科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn);羅氏P80全自動生化分析儀，上海政翔化學(xué)試劑研究所生產(chǎn);Genelight2400 PCR儀器，廈門安普利生物工程有限公司生產(chǎn)。

1．4 實驗方法

1．4．1 造模 本實驗根據(jù)周文江等在中國實驗動物學(xué)雜志上發(fā)表的制造豚鼠膽囊結(jié)石模型的方法建立豚鼠膽固醇結(jié)石模型［4］:取豚鼠60只隨機(jī)分成6組(空白對照組、模型組、低劑量中藥組、中劑量中藥組、高劑量中藥組、熊去氧膽酸組)，取其中5組予成石飼料(普通飼料中添加1．2%膽固醇、5%蔗糖、3．5%魚肝油)飼喂80天，正常組予普通飼料喂養(yǎng)。

1．4．2 給藥 造模后，對照組及模型組予正常飼料加生理鹽水灌胃喂養(yǎng)8周，其他4組分別予中藥大柴胡湯按低劑量(6g/(kg·d))、中劑量(12g/(kg·d))、高劑量(24g/(kg·d))，熊去氧膽酸(10g/(kg·d))灌胃加正常飼料喂養(yǎng)8周。

1．4．3 標(biāo)本采集與檢測 8周后分批處死豚鼠，動物處死前24h禁食禁水，予3%戊巴比妥鈉0.15mL/100g腹腔注射麻醉豚鼠，將豚鼠仰位固定于手術(shù)板，腹部剪毛后沿腹白線(腹正中線)剖開腹腔，尋找到膽囊，仔細(xì)抽吸膽汁，肉眼觀察有無結(jié)石，然后切除膽囊并剖開，再次觀察有無結(jié)石形成并作記錄。在無菌操作下仔細(xì)刮除黏膜后，將膽囊標(biāo)本放置于凍存管，于液氮中低溫保存。膽汁中總膽汁酸(TBA)含量采用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)測定;膽汁中黏蛋白濃度采用磷鎢酸沉淀－酚試劑法測定;膽固醇采用酶比色法測定，全自動生化儀檢測;膽囊壁組織用蘇木精－伊紅病理染色，光鏡下觀察;膽囊黏蛋白基因表達(dá)情況采用RT－PCR方法進(jìn)行研究觀察。

1．5 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析用SPSS19．0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)資料的統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料用ˉx±s表示，各組間比較采用單因素方差分析，方差檢驗齊者用最小顯著差數(shù)(LSD)法，方差不齊者用Games－Howell法檢驗。

2 結(jié)果

2．1 大柴胡湯對豚鼠膽汁中黏蛋白濃度的影響結(jié)果見表1。模型組豚鼠膽汁中黏蛋白濃度明顯高于空白組，中藥組黏蛋白濃度明顯低于熊去氧膽酸組，熊去氧膽酸組黏蛋白濃度較模型組明顯降低(P＜0．05)。

表1 大柴胡湯對豚鼠膽汁中黏蛋白的影響(ˉx±s，n=10)

2．2 大柴胡湯對豚鼠結(jié)石及膽汁分泌量的影響結(jié)果見表2。大柴胡湯能溶、排膽囊膽固醇結(jié)石，且低劑量效果較佳;低劑量大柴胡湯可明顯促進(jìn)膽汁分泌，中、高劑量大柴胡湯對膽汁分泌的促進(jìn)作用相對較弱。

表2 大柴胡湯對豚鼠結(jié)石、膽汁分泌量的影響(n=10)

2．3 大柴胡湯對豚鼠膽汁中膽固醇、膽汁酸含量的影響 結(jié)果見表3。與模型組相比，低劑量、中劑量大柴胡湯組和熊去氧膽酸片組豚鼠膽汁中膽汁酸含量較高(P＜0．01);在各組中，低劑量大柴胡湯組豚鼠膽汁中膽汁酸含量最高(P＜0．05)，中劑量及高劑量大柴胡湯組則相對較高;低劑量大柴胡湯組豚鼠膽汁中膽固醇含量最低(P＜0．01)。

表3 大柴胡湯對豚鼠膽汁中膽固醇、膽汁酸含量的影響(xˉ±s，n=10)

表4 大柴胡湯對豚鼠膽囊黏蛋白基因表達(dá)的影響(ˉx±s，n=10)

2．4 大柴胡湯對豚鼠膽囊壁組織的病理改變 光鏡下，正常組膽囊黏膜上皮細(xì)胞呈單層柱狀排列，黏膜皺壁完整。模型組膽囊部分被復(fù)腺上皮脫落或增生，黏膜間質(zhì)水腫、充血、炎細(xì)胞浸潤，而觀察組、對照組的上述病變較輕。

2．5 大柴胡湯對豚鼠膽囊蛋白基因表達(dá)的影響結(jié)果見表4。與模型組相比，低劑量、中劑量、高劑量大柴胡湯組和熊去氧膽酸片組豚鼠膽囊黏蛋白基因MUC3表達(dá)明顯較低(P＜0．01)，高劑量大柴胡湯組和熊去氧膽酸片組豚鼠膽囊黏蛋白基因MUC1、MUC2表達(dá)明顯偏低(P＜0．01);低劑量、中劑量大柴胡湯組豚鼠膽囊黏蛋白基因MUC1、MUC2表達(dá)較低(P＜0．05)。

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，膽石病和膽囊炎均為由氣及血，肝膽氣郁與膽汁壅阻、痰瘀互結(jié)互為因果，使得結(jié)石不斷增大，炎癥反復(fù)不愈，不斷損傷肝膽功能，形成了惡性循環(huán)，最終濕熱越聚越重衍生百病［5］。中醫(yī)認(rèn)為，“按之心下滿痛者，此為實也，當(dāng)下之，宜大柴胡湯”。大柴胡湯中柴胡、枳實、黃芩具有清利郁熱、疏肝利膽的功效;甘草坐鎮(zhèn)中州，合白芍酸甘化陰，既可以緩和瀉下藥物傷陰，同時防止邪熱入里傷陰。從現(xiàn)代藥理學(xué)分析，大黃內(nèi)的大黃素能有效地解除乙酰膽堿導(dǎo)致的痙攣，有松弛括約肌、加強膽囊收縮、膽管擴(kuò)張，促進(jìn)膽汁的排泄，驅(qū)除膽道異物且有抗菌作用;柴胡可以增加膽固醇－膽鹽系數(shù)，具有極強的利膽功能;白芍可以松弛肌肉，有助于膽汁排泄并具備鎮(zhèn)痛作用［6－7］。

當(dāng)膽汁中膽汁酸含量低而膽固醇含量高時，易形成膽固醇結(jié)晶。模型組的總膽汁酸較正常組明顯低，而膽固醇、黏蛋白含量則較高。觀察組能升高總膽汁酸濃度，降低膽固醇、黏蛋白含量，且作用明顯優(yōu)于對照組。黏蛋白可作為膽石基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)膽固醇結(jié)晶，或作為成核因子促使膽石形成，其濃度過高，還會增加膽汁黏度，使膽汁流動緩慢，易析出膽固醇結(jié)晶。結(jié)石膽囊黏膜中黏蛋白的表達(dá)與結(jié)石的形成密切相關(guān)［8－10］。有文獻(xiàn)報道，約50%的結(jié)石膽囊黏膜中存在不同黏蛋白基因的表達(dá)［8］。本研究通過觀察各組膽囊形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)模型組膽囊有明顯的炎癥、水腫，其炎癥刺激了膽囊黏蛋白分泌，故膽汁中黏蛋白濃度高。另外，水腫膽囊還使膽汁排泄不暢。應(yīng)用大柴胡湯治療后，發(fā)現(xiàn)膽汁中黏蛋白含量、膽汁黏度明顯降低，膽囊水腫減輕，改善了膽囊動力學(xué)環(huán)境。

本研究共測定了3種粘蛋白，其中MUC1、MUC2、MUC3在膽囊組織均有表達(dá)，這和陳東風(fēng)等［11］的報道一致。我們發(fā)現(xiàn)，MUC1在結(jié)石豚鼠膽囊黏膜中存在，而且比MUC2、MUC3表達(dá)的陽性率高，提示MUC1可能是正常膽囊黏膜上皮細(xì)胞分泌的主要黏蛋白。黏蛋白與結(jié)石形成及膽囊炎癥之間的關(guān)系較為復(fù)雜，推測可能系多種原因引起黏蛋白大量分泌，分子結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致或促進(jìn)了膽囊結(jié)石的形成，而結(jié)石又刺激黏膜炎癥的發(fā)生，腺體增生，進(jìn)一步導(dǎo)致黏蛋白分泌改變，使結(jié)石逐漸變大，但它們之間的確切關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，低劑量、中劑量、高劑量大柴胡湯和熊去氧膽酸片可明顯降低豚鼠膽囊黏蛋白基因MUC3的表達(dá)(P＜0．01)，高劑量大柴胡湯和熊去氧膽酸片可明顯降低豚鼠膽囊黏蛋白基因MUC1、MUC2的表達(dá)(P＜0．01)，低劑量、中劑量大柴胡湯可降低豚鼠膽囊黏蛋白基因MUC1、MUC2的表達(dá)(P＜0．05)。這可能與大柴胡湯治療后，改善了膽囊動力學(xué)環(huán)境有關(guān)。

實驗提示，大柴胡湯可使豚鼠膽汁中膽汁酸含量顯著升高，使膽固醇含量顯著降低;降低黏蛋白濃度，降低豚鼠膽囊黏蛋白基因表達(dá)，以小劑量為佳，中劑量次之，證明了大柴胡湯能降低豚鼠膽囊黏蛋白分泌及基因表達(dá)。本實驗為臨床提供了應(yīng)用依據(jù)。從本次的研究可看出，運用大柴胡湯能較好溶、排膽囊膽固醇結(jié)石，其機(jī)制與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，改善致石性膽汁及糾正膽囊動力學(xué)并降低膽囊粘蛋白基因表達(dá)等作用有關(guān)。

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