超聲波輔助提取鯰魚內(nèi)臟蛋白酶的工藝研究

張 嵐，衣杰榮

（上海海洋大學食品學院，上海201306）

超聲波輔助提取鯰魚內(nèi)臟蛋白酶的工藝研究

張 嵐，衣杰榮*

（上海海洋大學食品學院，上海201306）

以鯰魚內(nèi)臟為原料，采用超聲波輔助提取鯰魚胃、腸中的蛋白酶，分別研究了NaCl濃度、超聲提取時間、超聲波強度和提取溫度對胃、腸蛋白酶活性的影響，并通過響應面分析法對兩種鯰魚內(nèi)臟蛋白酶的提取工藝進行優(yōu)化。實驗結果表明，鯰魚胃蛋白酶最佳提取工藝條件為：NaCl溶液濃度0.3%，超聲波強度90 W，提取時間30 min，提取溫度為35℃，此時測得的蛋白酶活力為130 U/mL；腸蛋白酶的最佳提取工藝條件為：NaCl溶液濃度0.25%，超聲波強度100 W，提取時間40 min，提取溫度為35℃，此時測得的蛋白酶活力為114 U/mL。表明在同樣的料液比（1∶5）的提取條件下，所獲得的單位體積的胃蛋白酶提取液的酶活性顯著高于相應的腸蛋白酶提取液的酶活性。

鯰魚，內(nèi)臟，蛋白酶，響應面，超聲波輔助提取

鯰魚是國內(nèi)外養(yǎng)殖的主要淡水魚品種之一，也是世界上發(fā)展最迅速的養(yǎng)殖魚類，1995年全球養(yǎng)殖產(chǎn)量僅僅1.5萬噸，2008年增長到140萬噸，2010年接近180萬噸[1]。作為我國主要淡水魚出口品種之一，鯰魚在2006年出口量高達一萬噸[2]，之后趨于平緩，到2012年和2013年，國內(nèi)鯰魚的年養(yǎng)殖量均維持在1500 t左右[3]。鯰魚在加工中留下可食用肉質(zhì)部分，內(nèi)臟棄去不用。伴隨著大批量加工而產(chǎn)生的內(nèi)臟，不僅造成生態(tài)污染，而且也是一種極大的資源浪費[4]。內(nèi)臟中含有豐富的酶類物質(zhì)，大量研究表明魚類內(nèi)臟可作為蛋白酶的重要來源[4]。因此，研究鯰魚內(nèi)臟蛋白酶的提取工藝對鯰魚產(chǎn)品的綜合開發(fā)具有重要的現(xiàn)實意義。

目前國內(nèi)外在魚內(nèi)臟蛋白酶的研究上多側重于酶的分離純化和酶特性研究，包括：硫酸銨沉淀法[5]、色譜分析法[6]、雙水相萃取法[7]、三相分離法[8]等。研究者們圍繞這些酶的種類及其最適溫度、pH進行研究[9-10]，這些提取方法獲得的酶活性通常較高，但提取過程復雜、不易操作且提取成本高，不適合作為工業(yè)生產(chǎn)用酶制劑使用。而關于粗酶的提取工藝及提取條件優(yōu)化的研究報道相對較少。近年來超聲波輔助提取技術不斷發(fā)展，利用其強烈的空化效應、機械作用、攪拌作用等，可以加速蛋白酶進入溶劑，從而有效地提高提取效率[11-12]。超聲波輔助提取法具有提取方式簡單、無需加熱、提取率高、提取速度快、提取物的結構未被破壞、提取條件參數(shù)易于控制等優(yōu)點[13]。本文將超聲波輔助提取法應用于鯰魚內(nèi)臟蛋白酶的提取，在綜合參考文獻的基礎上[14-16]，確定采用固定料液比（1∶5），分別研究了NaCl濃度、超聲提取時間、超聲強度和提取溫度對提取得到的蛋白酶活性的影響，并且用響應面法優(yōu)化提取條件，為以后魚類內(nèi)臟蛋白酶的提取方法的研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論基礎和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮鯰魚 購自上海市浦東新區(qū)臨港新城農(nóng)工商超市，挑選個體均一、色澤光亮、健康有活力的新鮮活鯰魚；酪蛋白粉 Sigma公司；乳酸、乳酸鈉、硼酸鈉、氫氧化鈉、三氯乙酸、氯化鈉 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

FJ-200高速分散均質(zhì)機 上海本昂科學儀器有限公司；DHG-9023A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海新諾儀器廠；SK5200HP超聲波儀 上?？茖_式清洗器；H2050高速冷凍離心機 湘儀；HWS12電熱恒溫水浴鍋 蘇州江東精密儀器有限公司；UV-2100紫外分光光度計 UNICO；BCD-219D冰箱 海爾。

1.2 實驗方法

1.2.1 鯰魚內(nèi)臟蛋白酶提取方法 新鮮鯰魚宰殺后取出內(nèi)臟并洗凈，分離胃、腸，再次用蒸餾水洗凈，置于-18℃冰箱保存。用時解凍，稱重，以NaCl溶液為提取液，按內(nèi)臟與提取液為1∶5的料液比（W/V）加入一定濃度的NaCl溶液，均質(zhì)破碎2 min，破碎后超聲處理一段時間，取出后經(jīng)高速冷凍離心機離心（7000 r/min，4℃）20 min，取上清液為粗酶液[14]。

1.2.2 酶活性測定方法 參考張寒俊[17]和GB/T 23527-2009中蛋白酶活性的測定方法，加以修改。以10.00 mg/mL酪蛋白溶液為底物，配制不同pH的酪蛋白緩沖溶液。測胃蛋白酶活性時用pH2.5的酪蛋白緩沖溶液，測腸蛋白酶活用pH9.5的酪蛋白緩沖溶液。取1 mL粗酶液（必要時稀釋數(shù)倍）置于試管中37℃預熱，同時預熱相應pH下的蛋白酶緩沖溶液，之后加入1 mL酪蛋白緩沖溶液，37℃靜置反應10 min后加入2 mL 0.4 mol/L的三氯乙酸終止反應，過濾后用分光光度計于275 nm波長下測定其吸光度（OD）值，先加三氯乙酸再加蛋白酶液的對照管為空白。進行三次平行實驗。繪制酪氨酸標準曲線（參考GB/T 23527-2009），其回歸方程 y=0.0075x+0.0019，相關系數(shù)r= 0.9998。從標準曲線上根據(jù)OD值讀出樣品的酶活力，單位為U/mL。

1.2.3 超聲波提取蛋白酶單因素實驗設計

1.2.3.1 NaCl濃度對蛋白酶活性的影響 內(nèi)臟分別于0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%的NaCl溶液中勻漿（1∶5（W/V）），之后在25℃下80 W超聲提取60 min，確定NaCl濃度對蛋白酶活性的影響。

1.2.3.2 提取時間對蛋白酶活性的影響 內(nèi)臟按料液比1∶5（W/V）置于0.3%NaCl溶液中勻漿，之后分別在25℃下80 W超聲提取15、30、45、60、75、90、105 min，通過測定OD值反映不同超聲時間條件下提取出的蛋白酶活性，確定提取時間對蛋白酶活性的影響。

1.2.3.3 提取強度對蛋白酶活性的影響 內(nèi)臟按料液比1∶5（W/V）置于0.3%的NaCl溶液中勻漿，之后分別在25℃下用80、90、100、110 W的超聲強度處理30 min，通過測定OD值反映不同超聲波強度條件下提取出的蛋白酶活性，確定提取強度對蛋白酶活性的影響。

1.2.3.4 提取溫度對蛋白酶活性的影響 內(nèi)臟按料液比1∶5（W/V）置于0.3%的NaCl溶液中勻漿，之后分別在25、30、35、40、45、50℃下用90 W的超聲強度處理30 min，確定提取溫度對蛋白酶活性的影響。

1.2.4 蛋白酶提取的響應面實驗設計 根據(jù)單因素實驗的結果，選擇NaCl濃度、提取時間和提取強度三個主要因素。選擇NaCl濃度0.1%、0.3%和0.5%三個水平，提取時間15、30、45 min三個水平，提取強度選擇80、90、100 W三個水平，以蛋白酶活性（Y）為指標進行響應面實驗設計（見表1），優(yōu)化超聲波法提取胃蛋白酶的工藝。選擇NaCl濃度0.1%、0.3%和0.5%三個水平，提取時間30、45、60 min三個水平，提取強度選擇90、100、110 W三個水平，以蛋白酶活性（Y）為指標進行響應面實驗設計（見表2），優(yōu)化超聲波法提取腸蛋白酶的工藝。

表1 胃蛋白酶提取的響應面設計因素與水平Table 1 Factors and levers in the Box-Behnken of protease extracted in stomach

表2 腸蛋白酶提取的響應面設計因素與水平Table 2 Factors and levers in the Box-Behnken of protease extracted in intestine

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用DesignExpert 8.0.6軟件進行響應面優(yōu)化分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 NaCl濃度對酶活性的影響 由圖1可以看出，采用不同的NaCl濃度，提取的胃蛋白酶活性均大于腸蛋白酶活性。當NaCl濃度為0.3%左右時，鯰魚胃、腸蛋白酶活性均為最高。其中NaCl濃度＜0.3%時，隨著NaCl濃度的升高，酶活性明顯升高；而當NaCl濃度＞0.3%時，隨著NaCl濃度升高，其酶活下降速率相對緩慢。這說明在超聲波提取過程中，一定濃度的NaCl有助于內(nèi)臟蛋白酶的提取。這可能是與NaCl對蛋白酶的構象的穩(wěn)定作用有關。Klomklao等[18]研究了NaCl濃度對鯰魚內(nèi)臟蛋白酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)高濃度NaCl使酶活性大大降低，分析原因可能是鹽析作用使蛋白酶變性。

圖1 NaCl濃度對內(nèi)臟蛋白酶活性的影響Fig.1 Effect of different concentrations of NaCl on protease activity from viscera

2.1.2 超聲波提取時間對酶活性的影響 由圖2可以看出，超聲時間對從鯰魚腸中提取的蛋白酶活性有較明顯的影響，超聲時間為45 min時提取的酶活性最高，之后隨著超聲提取時間的增加，酶活性明顯下降，且伴有曲折。而從胃中提取的蛋白酶在超聲時間為60 min時的活性最低，超聲時間30 min和90 min提取到的酶活性相對較高。提取時間對鯰魚胃腸中不同種類的蛋白酶活性的影響機理還有待于進一步研究。

圖2 超聲時間對內(nèi)臟蛋白酶活性的影響Fig.2 Effect of different extraction times on protease activity from viscera

2.1.3 超聲波強度對酶活性的影響 由圖3可以看出，在不同的超聲波強度時，提取的胃蛋白酶活性總大于腸蛋白酶。在其他條件不變的情況下，90 W的超聲波強度提取得到的鯰魚胃蛋白酶活性最高，而從腸中提取出的蛋白酶在超聲波強度100 W時活性最高。胃、腸蛋白酶的活性受超聲波強度的影響較大，所以選擇合適的超聲波強度在胃蛋白酶和腸蛋白酶的提取過程中尤為重要。

圖3 超聲波強度對內(nèi)臟蛋白酶活性的影響Fig.3 Effect of different ultrasonic intensities on protease activity from viscera

2.1.4 超聲波提取溫度對酶活性的影響 由圖4可以看出，從胃、腸中提取的蛋白酶均在35℃提取時表現(xiàn)出最高的活性。此外，從胃中提取的蛋白酶在提取溫度為25℃時活性偏低，30℃之后迅速變大，之后幾乎保持平穩(wěn)，這表明低溫不利于胃中蛋白酶的提取。而腸中提取蛋白酶活性較胃中的小，50℃活性幾乎為0，這有可能是溫度高致使蛋白酶失活。在所有實驗的溫度下，提取的胃蛋白酶活性都大于腸蛋白酶。

圖4 超聲波提取溫度對內(nèi)臟蛋白酶活性的影響Fig.4 Effect of different extraction temperatures on protease activity from viscera

2.2 響應面分析對提取蛋白酶活性的影響

2.2.1 胃中提取蛋白酶的響應面分析 根據(jù)單因素實驗結果及實驗的實際情況，固定提取溫度為35℃，采用響應面分析法，對胃中提取的蛋白酶進行NaCl濃度、超聲波提取功率、超聲波提取時間的三因素三水平優(yōu)化，設計方案及實驗結果見表3。

利用Design Expert V8.0.6軟件分別對表3中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到胃蛋白酶活性對以上因素的二次多項回歸模型為Y=0.990－7.625×10-3A－6.750×10-3B－6.125×10-3C－1.500×10-3AB－7.750×10-3AC－0.034BC－0.10A2－0.024B2－0.11C2。

表4為回歸分析結果，回歸方差分析顯著性檢驗顯示該模型回歸顯著（p＜0.001），失擬項不顯著（p失擬＞0.05），表明模型失擬度不顯著；模型回歸系數(shù)R2= 0.9639，R2Adj=0.9175，信噪比（AdeqPrecision）=12.472，表明該模型擬合程度較好，誤差小，可以用此模型對蛋白酶的活性進行分析和預測。模型分析結果表明：交互項BC對結果的影響顯著，二次項A2、C2對結果的影響極顯著，表明超聲波提取功率和超聲波提取時間的交互作用對蛋白酶活性影響顯著。

表3 響應面分析實驗結果Table 3 Results of Box-Behnken

表4 回歸模型方差分析Table 4 Regression model analysis of variance

某兩個因素之間的交互影響見圖5～圖7，從曲面的陡勢和等高線的形狀可以直觀的了解因素間的相互作用對結果的影響。從圖中可以看出，超聲功率和超聲時間的交互影響對蛋白酶活性顯著，這三組交互作用的曲面中心頂點均接近于零水平，表明了經(jīng)響應面優(yōu)化的最佳提取條件應在三個因素的零水平左右。

圖5 NaCl濃度（A）與超聲功率（B）對鯰魚胃蛋白酶活性的影響Fig.5 Effect of NaCl concentration（A）and ultrasonic intensity（B）on protease activity from catfish stomach

圖6 NaCl濃度（A）與超聲時間（C）對鯰魚胃蛋白酶活性的影響Fig.6 Effect of NaCl concentration（A）and extraction time（C）on protease activity from catfish stomach

利用Design Expert軟件對模型進行分析得到胃中蛋白酶的最優(yōu)提取條件為：NaCl濃度為0.29%，超聲提取功率為88.65 W，超聲提取時間為29.90 min，在此條件下預測OD值為0.992。根據(jù)實驗實際情況固定提取溫度，調(diào)整NaCl濃度為0.30%，超聲提取功率為90 W，提取時間為30 min，進行驗證實驗，通過3次平行實驗得到蛋白酶活性的實際OD值為0.988，與預測值0.922的相對誤差僅在0.4%，證明用此模型優(yōu)化超聲波提取胃蛋白酶的工藝條件是可行的。根據(jù)酪氨酸標準曲線讀得此時粗蛋白酶液的酶活力為130 U/mL。

圖7 超聲功率（B）與超聲時間（C）對鯰魚胃蛋白酶活性的影響Fig.7 Effect of ultrasonic intensity（B）and extraction time（C）on protease activity from catfish stomach

2.2.2 腸中提取蛋白酶的響應面分析 根據(jù)單因素實驗結果及實驗的實際情況，固定提取溫度為35℃，采用響應面分析法，對腸中提取的蛋白酶進行NaCl濃度、超聲波提取功率、超聲波提取時間的三因素三水平優(yōu)化，設計方案及實驗結果見表5。

利用Design Expert V8.0.6軟件分別對表3中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到胃蛋白酶活性對以上因素的二次多項回歸模型為Y=0.860-0.048A＋0.040B-0.008C-0.002AB＋0.006AC＋0.001BC-0.06A2-0.061B2-0.020C2。

表6為回歸分析結果，回歸方差分析顯著性檢驗顯示該模型回歸顯著（p＜0.001），失擬項不顯著（p失擬＞0.05），表明模型失擬度不顯著；模型回歸系數(shù)R2= 0.9847，R2Adj=0.9650，信噪比（AdeqPrecision）=22.054表明該模型擬合程度較好，誤差小，可以用此模型對蛋白酶的活性進行分析和預測。模型分析結果表明：一次項A、B對結果的影響極顯著，二次項A2、B2對結果的影響極顯著，C2的影響顯著，表明NaCl濃度和超聲波提取功率對響應值有極顯著的影響，并且NaCl濃度、超聲波功率、超聲波時間這三個因素的交互作用對蛋白酶活性影響不顯著。

表5 響應面分析實驗結果Table 5 Results of Box-Behnken

其中某兩個因素之間的交互影響見圖8～圖10，從曲面的陡勢和等高線的形狀可以直觀的了解因素間的相互作用對結果的影響。從圖中可以看出，三組交互作用對蛋白酶活性的影響均不顯著，NaCl濃度和超聲功率的曲面陡勢明顯，表明這兩個因素對結果影響極顯著。

表6 回歸模型方差分析Table 6 Regression model analysis of variance

利用Design Expert軟件對模型進行分析得到腸中蛋白酶的最優(yōu)提取條件為：NaCl濃度為0.22%，超聲提取功率為103.39 W，超聲提取時間為41.21 min，在此條件下預測OD值為0.880。根據(jù)實驗實際情況固定提取溫度，調(diào)整NaCl濃度為0.25%，超聲提取功率為100 W，提取時間為40 min，進行驗證實驗，通過3次平行實驗得到蛋白酶活性的OD值為0.869，與預測值0.880的相對誤差為1.25%，表明用此模型優(yōu)化超聲波提取腸蛋白酶的工藝條件是可行的。根據(jù)酪氨酸標準曲線讀得此時粗蛋白酶液的酶活力為114 U/mL，低于上面得到的胃蛋白酶液的酶活力130 U/mL，這表明在同樣料液比的提取條件下，單位體積的胃蛋白酶提取液的蛋白酶活性顯著高于相應的腸蛋白酶提取液的蛋白酶活性。

圖8 NaCl濃度（A）與超聲功率（B）對鯰魚腸蛋白酶活性的影響Fig.8 Effect of NaCl concentration（A）and ultrasonic intensity（B）on protease activity from catfish intestine

圖9 NaCl濃度（A）與超聲時間（C）對鯰魚腸蛋白酶活性的影響Fig.9 Effect of NaCl concentration（A）and extraction time（C）on protease activity from catfish intestine

圖10 超聲功率（B）與超聲時間（C）對鯰魚腸蛋白酶活性的影響Fig.10 Effect of ultrasonic intensity（B）and extraction time（C）on protease activity from catfish intestine

3 結論

本研究采用超聲波輔助提取技術分別從鯰魚內(nèi)臟-胃和腸中提取蛋白酶。單因素實驗表明，NaCl濃度、超聲提取時間、超聲波強度和提取溫度都對鯰魚胃和腸中蛋白酶的提取有顯著地影響。在單因素實驗的基礎上，采用響應面分析法優(yōu)化工藝條件，得到鯰魚胃中蛋白酶最佳提取條件為：NaCl溶液濃度0.3%，超聲波強度90 W，提取時間30 min，此時測得的蛋白酶活力為130 U/mL；鯰魚腸中蛋白酶的最佳提取條件為：NaCl溶液濃度0.25%，超聲波強度100 W，提取時間40 min，測得蛋白酶活力為114 U/mL。表明在同樣料液比的提取條件下，所獲得的單位體積的胃蛋白酶提取液的酶活性顯著高于相應的腸蛋白酶提取液的酶活性。本研究表明采用超聲波提取法能有效地從內(nèi)臟中提取出高活性的蛋白酶粗液，提取產(chǎn)物適合應用到食品工業(yè)，為以后鯰魚內(nèi)臟蛋白酶的工業(yè)化提取和應用提供了很好的實驗依據(jù)。

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Ultrasonic-assisted extracting process of protease from catfish viscera

ZHANG Lan，YI Jie-rong*
（College of Food Science&Technology Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

The utilization of catfish processing by-products were studied in this paper.Crude protease from catfish stomach and intestine were extracted using ultrasonic method.The effects of various factors，including concentration of NaCl，extraction time，ultrasonic intensity and extraction temperature on protease from catfish stomach and intestine were investigated，respectively.The optimum conditions for the extraction of catfish viscera proteases were obtained by response surface analysis.The results showed that the optimum conditions of pepsin from stomach of catfish were as follows：0.3%NaCl solution，ultrasonic intensity 90 W，30 min of processing time and at 35℃.Under these optimized conditions，the measured protease activity reached 130 U/mL.The optimum conditions of protease from intestine of catfish were as follows：0.25%NaCl solution，ultrasonic intensity 100 W，40 min of processing time and at 35℃.Under these optimized conditions，the protease activity reached 114 U/mL.The result indicated that with the same solid to liquid extraction ratio（1∶5），protease from stomach had significantly higher enzyme activity than protease from intestine.

catfish；viscera；protease；response surface analysis；ultrasonic-assisted extraction

TS201.1

B

1002-0306（2015）22-0302-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.054

2015－03－04

張嵐（1991-），女，碩士研究生，研究方向：食品加工中的生物化學變化，E-mail：kkxiaoshizi310@163.com。

*通訊作者：衣杰榮（1969-），女，博士，講師，研究方向：食品加工中的生物化學變化，E-mail：jryi@shou.edu.cn。

哥本哈根大學食品系合作項目；上海海洋大學研究生科研項目基金。