明膠對(duì)甲醛捕獲條件的研究

儀淑敏，楊立平，李學(xué)鵬，徐永霞，李穎暢，勵(lì)建榮

（渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院，渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧錦州121013）

明膠對(duì)甲醛捕獲條件的研究

儀淑敏，楊立平，李學(xué)鵬，徐永霞，李穎暢，勵(lì)建榮*

（渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院，渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧錦州121013）

為了開發(fā)出能應(yīng)用于食品中的新型甲醛捕獲劑，本文以明膠為研究對(duì)象，采用單因素實(shí)驗(yàn)分析了時(shí)間、溫度、pH、濃度對(duì)明膠與甲醛的反應(yīng)特性。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以甲醛捕獲率為響應(yīng)值，通過Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)對(duì)明膠作為甲醛捕獲劑的捕獲條件進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步研究了明膠對(duì)甲醛的捕獲特性，結(jié)果表明明膠的最佳捕獲條件為：捕獲時(shí)間10 h、捕獲溫度30℃、pH8.0、明膠濃度1.0%，甲醛捕獲率可達(dá)80.97%。

明膠，甲醛，捕獲條件

甲醛又稱蟻醛，微帶酸性，具有強(qiáng)烈的刺激性氣味，對(duì)人和動(dòng)物具有較高的毒性，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、肺和肝臟均可產(chǎn)生損害[1]。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定甲醛不能作為食品添加劑應(yīng)用于食品。但是近年來，食品中經(jīng)常檢測(cè)出甲醛，引起人們的廣泛關(guān)注[2]。Rodriguez[3]調(diào)查了冷藏過程中的魷魚、鱈魚、沙丁魚等中甲醛本底含量，發(fā)現(xiàn)最高含量達(dá)41 mg/kg；Fu等[4]研究了甲醛的產(chǎn)生原因，發(fā)現(xiàn)高溫作用有助于氧化三甲胺分解為甲醛和二甲胺；Herrera等[5]研究了抑制甲醛產(chǎn)生的途徑，發(fā)現(xiàn)抗凍劑可抑制甲醛的產(chǎn)生。

甲醛捕獲劑又稱甲醛清除劑、甲醛消納劑或甲醛捕捉劑，是指在一定條件下能與甲醛發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的化合物的水溶液[6]。目前甲醛捕獲劑種類較多，但大多數(shù)都存在缺陷，如二次污染、影響產(chǎn)品性能、不適合在食品中應(yīng)用等[7]，俞其林[8]發(fā)現(xiàn)茶多酚能夠顯著降低秘魯魷魚絲中甲醛含量。開發(fā)出適用于食品行業(yè)的綠色新型甲醛捕獲劑是當(dāng)前研究熱點(diǎn)[9]。

明膠是動(dòng)物的皮、骨等通過部分酸法、堿法水解或酶解，提純而獲得的膠原蛋白[10]。是一種將膠原三螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為無規(guī)則鏈而獲得的蛋白質(zhì)，具有生物可降解性及良好的生物相容性[11]，因此在醫(yī)藥與食品上得到廣泛的應(yīng)用。Fahmi等[12]曾利用海鯛魚明膠制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性抑制肽，任龍芳等[13]比較了明膠、骨膠和氨基酸的除醛效果，其中明膠的甲醛去除率最高，達(dá)到50%。本實(shí)驗(yàn)對(duì)明膠捕獲甲醛的條件進(jìn)行了優(yōu)化，為開發(fā)出適用于食品的甲醛捕獲劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

明膠 化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈 色譜純，天津市天立化學(xué)試劑有限公司；2，4-二硝基苯肼（DNPH） 分析純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；甲醇 色譜純，TEDIA公司；甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液 分析純，國(guó)家環(huán)保總局；37%～40%甲醛溶液 分析純，沈陽市華東試劑廠。

Agilent HPLC1260高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技公司；1004精密電子天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 明膠與甲醛溶液的反應(yīng) 將37%～40%的甲醛溶液以適量倍數(shù)稀釋（約為10 μg/mL，以甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為參照），再將明膠配制成一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的溶液，以甲醛溶液和明膠溶液體積比（v/v）2∶1混合，用NaOH或HCl溶液調(diào)pH，搖勻，一定條件反應(yīng)，反應(yīng)后定容，充分搖勻。移取樣品溶液4 mL，測(cè)定殘余甲醛含量。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，同時(shí)用蒸餾水代替明膠做空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)甲醛與明膠反應(yīng)的影響 取5 mL 1.0%（w/v）的明膠溶液和10 mL的甲醛溶液于25 mL的具塞比色管中，在25℃條件下，考察反應(yīng)時(shí)間0、3、6、9、12 h對(duì)明膠與甲醛溶液反應(yīng)的影響。

1.2.2.2 反應(yīng)溫度對(duì)甲醛與明膠反應(yīng)的影響 取5 mL 1.0%（w/v）的明膠溶液和10 mL的甲醛溶液于25 mL的具塞比色管中，在4、20、40、60、80℃水浴中反應(yīng)12 h，考察反應(yīng)溫度對(duì)明膠與甲醛溶液反應(yīng)的影響。

1.2.2.3 pH對(duì)甲醛與明膠反應(yīng)的影響 取5 mL 1.0%（w/v）的明膠溶液和10 mL的甲醛溶液于25 mL的具塞比色管中，在20℃水浴中反應(yīng)12 h，考察pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0對(duì)明膠與甲醛溶液反應(yīng)的影響。

1.2.2.4 明膠濃度對(duì)甲醛與其反應(yīng)的影響 取5 mL不同濃度的明膠溶液（0.2%、0.5%、0.8%、1.0%、5.0%、10.0%，w/v）和10 mL的甲醛溶液于25 mL的具塞比色管中，在pH為8.0，溫度為20℃的水浴中反應(yīng)12 h，考察明膠濃度對(duì)其與甲醛溶液反應(yīng)的影響。

1.2.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步研究時(shí)間、溫度、pH和明膠濃度對(duì)明膠與甲醛反應(yīng)的影響，設(shè)計(jì)了4因素3水平的組合實(shí)驗(yàn)，考察時(shí)間、溫度、pH和明膠濃度4個(gè)因素對(duì)甲醛捕獲率的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平表Table 1 Factors and levels for RSD

1.2.3 甲醛檢測(cè)方法 根據(jù)勵(lì)建榮等建立的方法[14]略有改進(jìn)，利用高效液相色譜法測(cè)定甲醛含量，甲醛與DNPH于60℃水浴衍生生成2，4-二硝基苯腙，經(jīng)ODS-C18柱分離，紫外檢測(cè)器于波長(zhǎng)355 nm下檢測(cè)，以保留時(shí)間定性，峰面積定量，間接測(cè)出甲醛含量。測(cè)定時(shí)取4 mL樣品溶液，加入DNPH衍生劑2 mL，60℃下衍生30 min，流水冷卻，0.45 μm濾膜過濾后，取10 μL進(jìn)樣檢測(cè)。

1.2.4 甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別取10 μg/mL的甲醛標(biāo)準(zhǔn)液0.00、0.20、0.40、0.80、1.20、2.00 mL于10 mL具塞比色管中，加蒸餾水至4.0 mL。加入0.5 mg/mL的DNPH 2 mL，于60℃水浴中放置30 min，然后在流水中快速冷卻，用0.45 μm濾膜過濾后，取10 μL進(jìn)樣，測(cè)量保留時(shí)間和峰面積，每種濃度測(cè)定三次，取平均值，用峰面積和甲醛含量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 甲醛捕獲率的計(jì)算 甲醛捕獲率（%）=（A-X）/A×100；式中：A-甲醛原始含量，μg/mL；X-樣品中甲醛含量，μg/mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 18.0的ANOVA作方差分析，差異顯著性p＜0.05；由Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線

對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸統(tǒng)計(jì)，得出甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程：Y=243.62X+4.00，R2=0.9995。

圖1 甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of formaldehyde

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)甲醛與明膠反應(yīng)的影響 隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，甲醛捕獲率顯著增加（p＜0.05）。反應(yīng)9 h內(nèi)，甲醛減少量顯著，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間分別為9 h和12 h時(shí)，甲醛捕獲率分別為56.47%和59.34%，甲醛的減少趨于平緩，可能是因?yàn)榉磻?yīng)時(shí)間較短時(shí)，捕獲劑上的羧基未得到活化，阻礙了反應(yīng)的順利進(jìn)行，而當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行一段時(shí)間后，氨基的數(shù)量已達(dá)到飽和狀態(tài)，所以甲醛捕獲率也相應(yīng)地達(dá)到最大值[15]。

圖2 時(shí)間對(duì)甲醛與明膠反應(yīng)的影響Fig.2 The effect of time on reaction of formaldehyde with gelatin

2.2.2 反應(yīng)溫度對(duì)甲醛與明膠反應(yīng)的影響 4℃時(shí)明膠與甲醛的反應(yīng)活性最低，甲醛的減少量不顯著；隨著溫度的升高，相鄰處理間甲醛減少量的差異顯著（p＜0.05），且溫度為20℃時(shí)，甲醛捕獲率達(dá)到最大值72.60%，隨著溫度升高甲醛捕獲率逐漸減少，由此可見較高溫度不利于明膠與甲醛發(fā)生反應(yīng)，這可能是明膠自身的羧基和氨基在較高溫度下容易發(fā)生自身交聯(lián)，減少了氨基與甲醛的結(jié)合[15]。因此在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，可采用20℃左右使甲醛捕獲率達(dá)到較好值。

圖3 溫度對(duì)甲醛與明膠反應(yīng)的影響Fig.3 The effect of temperature on reaction of formaldehyde with gelatin

2.2.3 pH對(duì)明膠與甲醛反應(yīng)的影響 在pH1.0～8.0范圍內(nèi)，隨著pH的增大，甲醛減少量顯著增加（p＜0.05），當(dāng)pH為8.0時(shí)甲醛捕獲率達(dá)到72.13%；在pH8.0～10.0范圍內(nèi)，隨著pH的增大，甲醛捕獲率顯著減少（p＜0.01）；但隨著pH的進(jìn)一步增大，甲醛含量又相應(yīng)減少，這是由于甲醛在堿性條件下發(fā)生歧化作用，一分子甲醛被氧化成甲酸，另一分子甲醛被還原成甲醇，該反應(yīng)亦被稱為卡尼查羅（Cannizzaro）反應(yīng)[16]。由此可見，pH對(duì)甲醛與明膠反應(yīng)影響較大，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)可采取偏中性環(huán)境。

圖4 pH對(duì)明膠與甲醛反應(yīng)的影響Fig.4 The effect of pH on reaction of formaldehyde with gelatin

2.2.4 明膠濃度對(duì)甲醛與其反應(yīng)的影響 明膠與甲醛溶液在20℃、pH8.0的條件下反應(yīng)12 h，不同濃度的明膠溶液與甲醛反應(yīng)結(jié)果見圖5。可以得出明膠濃度對(duì)甲醛捕獲率有顯著性影響（p＜0.05），濃度由0.2%升到0.8%時(shí)，甲醛捕獲率顯著增加（p＜0.01），再隨著濃度升高，明膠與甲醛的反應(yīng)將趨于平衡，可能是由于高濃度的明膠溶液本身容易發(fā)生交聯(lián)，阻止了明膠與甲醛的反應(yīng)。因此實(shí)驗(yàn)時(shí)可選用0.8%左右的明膠溶液，參考圖5，本實(shí)驗(yàn)選取0.5、1.0、1.5進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

圖5 明膠濃度對(duì)甲醛與其反應(yīng)的影響Fig.5 The effect of concentration on reaction of formaldehyde with gelatin

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化明膠捕獲甲醛的條件

設(shè)計(jì)4因素3水平的組合實(shí)驗(yàn)，考察溫度、時(shí)間、pH和明膠濃度四個(gè)因素對(duì)明膠與甲醛反應(yīng)的影響，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，甲醛捕獲率最高值可達(dá)82.12%。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面多元回歸擬合，方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results

由方差分析結(jié)果可知，模型F值為11.19，p＜0.0001，表明模型極顯著，說明使用該方程模擬4因素3水平的分析是可行的；失擬項(xiàng)F值為4.08，表明失擬項(xiàng)與凈誤差的發(fā)生是不顯著的，其中9.38%的發(fā)生機(jī)會(huì)是由于噪音引起的，失擬項(xiàng)不顯著表明這個(gè)模型是合理的；回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9180，說明響應(yīng)值的變化有91.80%來源于所選變量，即甲醛捕獲率的變化有91.80%的原因來源于時(shí)間、溫度、pH、明膠濃度。在這個(gè)模型中B、C、D、AD、BD、B2對(duì)甲醛的捕獲影響顯著，說明溫度、pH、明膠濃度及時(shí)間與明膠濃度的交互作用、溫度與明膠濃度的交互作用對(duì)明膠與甲醛反應(yīng)的影響較大。在四種因素的交互作用下，各因素對(duì)甲醛捕獲率的影響順序是B＞C＞D＞A，即溫度＞pH＞明膠濃度＞時(shí)間。因此，該回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以用其確定最佳捕獲條件。

圖6和圖7為響應(yīng)面曲面圖，從曲面圖可以看出時(shí)間對(duì)甲醛捕獲率的影響不顯著；溫度對(duì)甲醛捕獲率的影響是隨著溫度的升高先升高，再降低，在30～40℃時(shí)達(dá)到最大值；明膠濃度在中心組合選取的范圍內(nèi)是隨著濃度的變大，甲醛捕獲率也隨之變大。經(jīng)過軟件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的最終理論值為：捕獲時(shí)間10.60 h、捕獲溫度30.89℃、pH7.93、明膠濃度1.28%，甲醛捕獲率為83.07%。考慮到實(shí)際操作，將以上條件校正為捕獲時(shí)間10 h、捕獲溫度30℃、pH8.0、明膠濃度1.0%，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明此時(shí)甲醛捕獲率為80.97%，與理論值較一致。

3 結(jié)論

單因素結(jié)果表明反應(yīng)時(shí)間、溫度、pH及明膠濃度均可顯著影響明膠對(duì)甲醛的捕獲率。

圖7 溫度與濃度曲面圖Fig.7 The surface figure of temperature and concentration

響應(yīng)面分析確定了明膠對(duì)甲醛捕獲的最佳條件：捕獲時(shí)間10 h、捕獲溫度30℃、pH8.0、明膠濃度1.0%，甲醛捕獲率為80.97%。其中溫度對(duì)反應(yīng)影響最顯著，其次是pH、明膠濃度，時(shí)間最小。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明明膠捕獲甲醛效果顯著，該方法對(duì)食品中的甲醛捕獲有良好的應(yīng)用前景。但是在添加過程中應(yīng)合理控制食品存放環(huán)境的溫度和時(shí)間，防止食品變質(zhì)，影響到產(chǎn)品的其他品質(zhì)。

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Capture conditions of gelatin with formaldehyde

YI Shu-min，YANG Li-ping，LI Xue-peng，XU Yong-xia，LI Ying-chang，LI Jian-rong*
（College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，Bohai University，Jinzhou 121013，China）

In order to develop a new type of formaldehyde capture agent used in food，the characteristics of gelatin with formaldehyde reaction were investigated under time，temperature，pH value and the concentration of gelatin in this paper.Based on single factor test，the Box-Benhnken central composite experimental test was designed by using optimum range for the reactivity of gelatin as formaldehyde scavenger with formaldehyde. The results showed that the optimum gelatin capture conditions：capture time 10 h，trapping temperature 30℃，pH value of 8.0，gelatin concentration 1.0%，formaldehyde capture rate of 80.97%.

gelatin；formaldehyde；capture conditions

TS254.1

B

1002-0306（2015）22-0227-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.039

2015-02-05

儀淑敏（1980-），女，博士，副教授，主要從事水產(chǎn)品貯藏加工及質(zhì)量安全控制方面的研究，E-mail：yishumin@163.com。

*通訊作者：勵(lì)建榮（1964-），男，博士，教授，主要從事水產(chǎn)品、果蔬貯藏加工及安全控制方面的研究，E-mail：lijr6491@163.com。

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題（2012BAD29B06；2015BAD17B01）；國(guó)家自然基金（31301418，31201308）；遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；遼寧省高校重大科技平臺(tái)；遼寧省高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)；遼寧省高等學(xué)校攀登學(xué)者支持計(jì)劃。