響應(yīng)曲面法優(yōu)化蝸牛酶輔助提取黑木耳多糖工藝

楊春瑜，劉海玲，楊春莉，景志剛，徐曉鑫，翟 森

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江省食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150076；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)輕工學(xué)院，黑龍江哈爾濱150028；3.黑龍江省玄鳥(niǎo)生物科技有限公司，黑龍江哈爾濱164831）

響應(yīng)曲面法優(yōu)化蝸牛酶輔助提取黑木耳多糖工藝

楊春瑜1，劉海玲1，楊春莉2，景志剛1，徐曉鑫3，翟 森1

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江省食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150076；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)輕工學(xué)院，黑龍江哈爾濱150028；3.黑龍江省玄鳥(niǎo)生物科技有限公司，黑龍江哈爾濱164831）

以黑木耳超微粉為原料，采用蝸牛酶酶解法，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法對(duì)黑木耳多糖的酶提工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：酶解時(shí)間2.5 h，酶解溫度為55.0℃，pH為6.8，酶的添加量為1.3%。在此條件下，多糖得率為31.1%，與理論預(yù)測(cè)值30.34%的相對(duì)誤差約為0.76%，重現(xiàn)性良好。說(shuō)明通過(guò)響應(yīng)曲面優(yōu)化得到的回歸方程具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

黑木耳，多糖，超微粉碎，蝸牛酶，響應(yīng)曲面

黑木耳營(yíng)養(yǎng)成分中主要的活性物質(zhì)是多糖[1-2]，黑木耳多糖具有許多生理活性，如：抗腫瘤、抗氧化、降血脂、降血糖和增強(qiáng)免疫等作用[3]。目前，在正常中性水提條件下，黑木耳多糖的得率不高，集中在10%左右。通過(guò)細(xì)胞壁破碎，可以促進(jìn)內(nèi)容物溶出，提高黑木耳多糖的得率[4]。超微粉碎、酶法和堿法降解均可以使黑木耳細(xì)胞壁破碎，多糖溶出率明顯提高[5]。

黑木耳屬于陸生真菌，其細(xì)胞壁的主要組成成分有葡聚糖、甘露聚糖和幾丁質(zhì)等，而蝸牛酶這種復(fù)合酶能同時(shí)降解葡聚糖、甘露聚糖和幾丁質(zhì)等[6]。因此，將蝸牛酶用于真菌黑木耳的破壁，能使其細(xì)胞內(nèi)的活性物質(zhì)多糖更好地釋放出來(lái)[7-10]，同時(shí)結(jié)合機(jī)械法超微粉碎進(jìn)行黑木耳細(xì)胞破壁，可以進(jìn)一步提高多糖的得率。本文以黑木耳超微粉為原料，采用蝸牛酶解法，以酶解時(shí)間、酶解溫度、酶解pH、酶的添加量為變量因素，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)對(duì)黑木耳多糖的酶提工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑木耳 黑龍江省方正縣林業(yè)局提供；蝸牛酶（破壁率80%～90%、最適pH5.8～7.2） 中國(guó)生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉（AR）、濃硫酸（AR）、苯酚（AR）天津市化學(xué)試劑三廠。

LG10-2.4A型高速離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司；ESJ120-4電子天平 沈陽(yáng)龍騰電子稱量?jī)x器公司；LK-2000A搖擺式高速中藥粉碎機(jī) 新昌縣城關(guān)紅利數(shù)控制造廠；721E型可見(jiàn)光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司；78-1型磁力加熱攪拌器 上海南江電汎器材廠；DK-98-I型電子恒溫水浴 天津泰斯特儀器公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；DHG-9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；CJM超細(xì)粉碎機(jī) 宜興市宏達(dá)通用設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑木耳超微粉的制備 將黑木耳原料用搖擺式高速中藥粉碎機(jī)粉碎，過(guò)100目篩后得到的粗粉用超微粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，即得到黑木耳超微粉。黑木耳超微粉用乙醚脫脂，索氏提取6 h，乙醚揮發(fā)干凈后，貯存干燥通風(fēng)條件下，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 黑木耳多糖的提取 取0.1 g黑木耳超微粉置于試管中，加入10 mL蒸餾水，浸泡12 h。加入0.001 g蝸牛酶，分別以酶解時(shí)間、酶解溫度、酶解pH、酶添加量為變量因素，然后加入4.4 mol/L NaOH溶液1 mL，溫度升高至80℃，提取2 h，4100 r/min離心30 min，測(cè)上清液中糖含量。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 固定酶解溫度為40℃、酶解pH為7、酶的添加量為0.1%，研究酶解時(shí)間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h時(shí)的多糖得率，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.2 酶解溫度對(duì)多糖得率的影響 固定酶解時(shí)間為1 h、酶解pH為7、酶的添加量為0.1%，研究酶解溫度為35、40、45、50、55℃時(shí)的多糖得率。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.3 酶解pH對(duì)多糖得率的影響 固定酶解溫度為40℃、酶解時(shí)間1 h、酶的添加量為0.1%，研究酶解pH為4、5、6、7、8時(shí)的多糖得率。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.4 酶的添加量對(duì)多糖得率的影響 固定酶解溫度為40℃、酶解pH為7、酶解時(shí)間1 h，研究酶的添加量0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%時(shí)的多糖得率。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以酶解時(shí)間、酶解溫度、酶解pH、酶的添加量為變量，多糖得率為指標(biāo)，進(jìn)行響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素水平編碼見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.5 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10.0000 mg，置于250 mL容量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，即可得到濃度為0.04 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液[13]。準(zhǔn)確稱取苯酚6 g于燒杯中，加水至100 mL，置于棕色瓶中，搖勻，備用。分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于9支試管中，各以水補(bǔ)至2.0 mL，然后分別加入6%苯酚1.0 mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL，迅速搖勻，靜置10 min，搖勻，室溫放置20 min，用可見(jiàn)光分光光度計(jì)于490 nm處測(cè)其吸光度，以2.0 mL水按同樣顯色操作為空白（10只試管），以橫坐標(biāo)為多糖濃度，縱坐標(biāo)為光密度值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 多糖含量的測(cè)定 采用苯酚硫酸法。分別取離心后的上清液1 mL于試管中，樣品根據(jù)實(shí)際情況稀釋倍數(shù)100倍。用水補(bǔ)至2.0 mL，然后分別加入6%苯酚1.0 mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL，迅速搖勻，靜置10 min，搖勻，室溫放置20 min，用可見(jiàn)光分光光度計(jì)于490 nm處測(cè)其吸光度，以2.0 mL水按同樣顯色操作為空白對(duì)照。根據(jù)樣品的OD值，計(jì)算出樣品中糖的濃度。多糖得率計(jì)算公式：

式中：X—黑木耳多糖得率（%）；C—上清液多糖濃度（mg/mL）；V—上清液體積（mL）；M—黑木耳粉的質(zhì)量（mg）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文采用Design Expert軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1，回歸方程為y=12.852x＋0.0347，方程的擬和度R2=0.9905。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 如圖2所示，酶解0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h時(shí)，多糖的得率分別為14.12%、15.40%、20.83%、23.21%、21.17%。隨著酶解時(shí)間的增加，酶的作用于細(xì)胞壁的效果達(dá)到最大，多糖的得率明顯升高，當(dāng)酶解2 h時(shí)，多糖得率達(dá)到最大，之后酶的作用開(kāi)始減弱，產(chǎn)物的生成對(duì)反應(yīng)體系造成了抑制作用，又開(kāi)始下降?？梢?jiàn)，酶解的時(shí)間可以確定在2 h左右。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Enzymolysis time effect on yield of polysaccharide

2.2.2 酶解溫度對(duì)多糖得率的影響 如圖3所示，在35、40、45、50、55℃下進(jìn)行酶解，得到的多糖得率分別為7.58%、14.48%、18.65%、23.78%、14.71%。隨著酶解溫度的增加，酶作用于細(xì)胞壁的效果越好，細(xì)胞壁裂解的越多，使多糖更容易的釋放出來(lái)，多糖的得率明顯升高，當(dāng)溫度為50℃時(shí)，多糖得率達(dá)到最大值，之后溫度繼續(xù)升高，超過(guò)了酶的最適溫度，多糖得率開(kāi)始下降?？梢?jiàn)，酶解的溫度，確定在50℃左右為宜。

圖3 酶解溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Enzymolysis temperature effect on yield of polysaccharide

2.2.3 酶解pH對(duì)多糖得率的影響 如圖4所示，pH為4、5、6、7、8時(shí)得到的多糖得率分別為10.01%、11.12%、25.31%、22.32%、16.47%，隨著酶解pH的升高，越趨近于蝸牛酶最適pH（5.8～7.2），使得多糖得率升高。當(dāng)pH為6時(shí)，多糖得率達(dá)到最大值，隨著pH的繼續(xù)升高，超出最適pH范圍，多糖的得率開(kāi)始下降，因此，pH為6左右時(shí)為最佳的pH范圍。

圖4 酶解pH對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Enzymolysis pH effect on yield of polysaccharide

2.2.4 酶的添加量對(duì)多糖得率的影響 如圖5所示，蝸牛酶的添加量0.5、1、1.5、2、2.5%時(shí)，多糖的得率分別為16.71%、21.40%、27.51%、20.57%、21.2%。隨著蝸牛酶添加量的增加，酶逐漸作用于黑木耳的細(xì)胞壁，多糖的得率也相應(yīng)的升高，當(dāng)蝸牛酶的添加量為1.5%時(shí)，多糖的得率達(dá)到最高，之后隨蝸牛酶添加量的升高，細(xì)胞壁被完全水解，多糖得率逐漸趨于平穩(wěn)?？梢?jiàn)蝸牛酶最適添加量在1.5%左右為宜。

圖5 酶的添加量對(duì)多糖得率的影響Fig.5 Enzymolysis addition effect on yield of polysaccharide

2.3 響應(yīng)曲面提取條件的優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以酶解時(shí)間、酶解溫度、加酶量、酶解pH為因子，多糖得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

使用Design Expert 7.0軟件[14-15]，對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到表3回歸方程方差分析表，利用軟件進(jìn)行非線性回歸的二次多項(xiàng)式擬合，得到預(yù)測(cè)模型如下：

Y=-646.74333＋0.94333A＋23.95367B＋2.52667C＋71.46667D＋1.10400AB＋2.24000AC-14.26000AD＋0.65000BC-0.050000BD＋2.18000CD-11.93333A2-0.29503B2-3.39083C2-18.53333D2

回歸方差分析顯著性檢驗(yàn)表明，該模型回歸顯著（p＜0.05），失擬項(xiàng)不顯著，且該模型R2=0.9785，說(shuō)明該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可以用于黑木耳多糖提取工藝實(shí)驗(yàn)的預(yù)測(cè)。

方程的一次項(xiàng)B對(duì)響應(yīng)值的影響顯著，二次項(xiàng)B（酶解溫度）、C（酶解pH）、D（酶添加量）對(duì)響應(yīng)值的影響顯著。由此可見(jiàn)，各具體實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的的線性關(guān)系[16-18]。

各因素的影響程度分析，各因素的F值可以反映因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的重要性，F(xiàn)值越大，表明對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響越大，即重要性越大，從方差分析表可知：FA=0.043，F(xiàn)B=4.72，F(xiàn)C=3.52，F(xiàn)D=0.87，即各因素對(duì)黑木耳多糖得率影響程度大小順序?yàn)椋好附鉁囟龋久附鈖H＞酶添加量＞酶解時(shí)間。

根據(jù)回歸方程，做出響應(yīng)曲面分析圖（圖6～圖11），考察所擬合的相應(yīng)曲面的形狀，分析酶解時(shí)間、酶解溫度、解pH、酶的添加量對(duì)黑木耳多糖得率的影響。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Results of response surface experiments of Box-Behnken

2.3.2 各因素之間的交互作用 圖6中可見(jiàn)，酶解溫度固定不變值時(shí)，多糖得率隨酶解時(shí)間增加先緩慢增加后降低。酶解時(shí)間固定時(shí)，多糖得率隨酶解溫度也是先增后減。多糖最大提取率在52.5℃和2.25 h左右。兩因素的交互作用不明顯。圖7與圖6的因素變化趨勢(shì)一致，且酶解pH與酶解時(shí)間交互作用不明顯。

圖6 酶解時(shí)間和酶解溫度對(duì)多糖得率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface of time and temperature of enzyme on the yield of polysaccharide

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis results of regression and variance

圖7 酶解時(shí)間和酶解pH對(duì)多糖得率的響應(yīng)曲面圖Fig.7 Response surface of time and pH of enzyme on the yield of polysaccharide

圖8 酶解時(shí)間和酶的添加量對(duì)多糖得率的響應(yīng)曲面圖Fig.8 Response surface of time and addition of enzyme on the yield of polysaccharide

圖8中可見(jiàn)，酶添加量固定值時(shí)，多糖得率隨酶解時(shí)間增加的速度先快后慢，最后趨于穩(wěn)定。酶解時(shí)間固定時(shí)，多糖得率隨酶添加量先增后減。多糖最大提取率在酶添加量1.5%和2.5 h左右。兩因素有較明顯的交互作用影響。同理，圖9中，酶解pH與酶解溫度有顯著的交互作用影響。

圖9 酶解溫度和酶解pH對(duì)多糖得率的響應(yīng)曲面圖Fig.9 Response surface of PH and temperature of enzyme on the yield of polysaccharide

圖10 酶解溫度和酶的添加量對(duì)多糖得率的響應(yīng)曲面圖Fig.10 Response surface of addition and temperature of enzyme on the yield of polysaccharide

圖11 酶解pH和酶的添加量對(duì)多糖得率的響應(yīng)曲面圖Fig.11 Response surface of addition and pH of enzyme on the yield of polysaccharide

圖10、圖11中可見(jiàn)，4因子的變化趨勢(shì)均是先增后減，且交互作用不顯著。

2.3.3 最佳組合及其驗(yàn)證 為進(jìn)一步確定最佳點(diǎn)，在模型濃度范圍內(nèi)選擇出發(fā)點(diǎn)，使用快速上升法進(jìn)行優(yōu)化得到的黑木耳多糖圖區(qū)的最佳方案為：酶解時(shí)間2.50 h，酶解溫度為55.02℃，pH為6.89，酶的添加量為2.33%，多糖得率為30.34%。

考慮到實(shí)際操作的便利，對(duì)提取工藝參數(shù)修正為：酶解時(shí)間2.5 h，酶解溫度為55.0℃，pH為6.8，酶的添加量為1.3%，三次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的黑木耳多糖得率分別為31.2%、29.4%、32.6%，平均多糖得率為31.1%，與理論預(yù)測(cè)值相比，兩者相差0.76%，說(shuō)明上述模型穩(wěn)定可用。

3 結(jié)論

采用蝸牛酶作用于超微粉碎后的黑木耳，對(duì)多糖進(jìn)行提取，通過(guò)單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并擬合酶解時(shí)間、酶解溫度、酶解pH、酶的添加量對(duì)多糖得率的回歸模型，經(jīng)檢驗(yàn)證明該模型合理可靠，能較好地預(yù)測(cè)蝸牛酶對(duì)黑木耳多糖的得率影響。由該模型確定的最優(yōu)條件為：酶解時(shí)間為2.5 h，酶解溫度為55.0℃，pH為6.8，酶的添加量為1.3%，在此條件下，多糖得率為31.1%。通過(guò)模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，得到各因素的主效應(yīng)關(guān)系為：酶解溫度＞酶解pH＞酶的添加量＞酶解時(shí)間。

目前，將蝸牛酶應(yīng)用于真菌多糖的提取中還沒(méi)有得到廣泛的應(yīng)用，為了充分開(kāi)發(fā)陸生真菌類多糖這一活性多糖，仍需要加大科研力度，完善黑木耳等陸生真菌類多糖的提取分離基本理論和方法，滿足工業(yè)化產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的需要。

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Optimization of the snailase assistant extraction process of polysaccharides from Auricularia Auricula by response surface methodology

YANG Chun-yu1，LIU Hai-ling1，YANG Chun-li2，JING Zhi-gang1，XU Xiao-xin3，ZHAI Sen1
（1.Key Laboratory for Food Science&Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China；2.College of Light Industry，Harbin University of Commerce，Harbin 150028，China 3.Heilongjiang Phoenix Bio-tech Co.，Ltd.，Harbin 164831，China）

In this paper，superfine powder of Auricularia Auricular was selected as raw material，and polysaccharide from Auricularia Auricular was extracted by enzyme hydrolysis by snailase.On the basis of the single factor experiment，extraction condition was optimized through method of response surface.The results showed that：the optimal extraction condition was enzymatic hydrolysis time 2.5 h，enzymatic hydrolysis temperature 55.0℃，pH6.8 and enzyme concentration 1.3%.Under above conditions，yield of polysaccharide reached 31.1%，the relative average error between predicted yield and actual value was 0.76%，and the reproducible was reliable.So，it was proved that the response surface equation of optimized extracted condition derived some practical significance.

Auricularia Auricula；polysaccharides；ultra-fine；snail enzymes；response surface methodology

TS201.2

A

1002-0306（2015）22-0198-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.033

2015－02－02

楊春瑜（1975-），女，博士，教授，研究方向：生物分離純化技術(shù)，E-mail：catherineyang88@126.com。

黑龍江省教育廳青年骨干教師項(xiàng)目（G1155G24）。