硫氧環(huán)蛋白過氧化物酶3對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌肥大的影響

趙霞 梁婷婷 裴強(qiáng) 王洪波范玉磊 魏中秋 馮莉 孫影▲

1.河北聯(lián)合大學(xué)冀唐學(xué)：醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河北唐山063300；2.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)：病理學(xué)系，河北唐山063000；3.河北聯(lián)合大學(xué)附屬遵化市人民醫(yī)院心內(nèi)科，河北唐山064200；4.河北聯(lián)合大學(xué)附屬遵化市人民醫(yī)院外科，河北唐山064200

硫氧環(huán)蛋白過氧化物酶3對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌肥大的影響

趙霞1梁婷婷2裴強(qiáng)3王洪波4范玉磊2魏中秋2馮莉2孫影2▲

1.河北聯(lián)合大學(xué)冀唐學(xué)：醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河北唐山063300；2.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)：病理學(xué)系，河北唐山063000；3.河北聯(lián)合大學(xué)附屬遵化市人民醫(yī)院心內(nèi)科，河北唐山064200；4.河北聯(lián)合大學(xué)附屬遵化市人民醫(yī)院外科，河北唐山064200

目的觀察硫氧環(huán)蛋白過氧化物酶3（Prdx-3）在血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大中的作用，并探討其作用機(jī)制。方法體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞（H9C2）隨機(jī)分為對(duì)照組、AngⅡ組、AngⅡ+轉(zhuǎn)染對(duì)照組和AngⅡ+Prdx-3轉(zhuǎn)染組。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將Prdx-3表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，Western blot法檢測(cè)Prdx-3蛋白表達(dá)，Real-time PCR法檢測(cè)腦鈉素（BNP）mRNA表達(dá)，二氯熒光素二乙酸（DCFH-DA）檢測(cè)活性氧（ROS）水平。結(jié)果Prdx-3表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后，Prdx-3蛋白表達(dá)值為（0.88±0.12），高于轉(zhuǎn)染對(duì)照組（0.38±0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，AngⅡ組BNP mRNA[（1.00±0.00）比（1.72±0.29）]、ROS[（3473±81）比（4439±111）]及Prdx-3蛋白表達(dá)水平[（0.33±0.05）比（0.72±0.14）]均明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。AngⅡ+轉(zhuǎn)染對(duì)照組和AngⅡ組的BNP mRNA[（1.72±0.29）比（1.94±0.34）]、ROS[（4439±111）比（4285±167）]及Prdx-3蛋白水平[（0.72± 0.14）比（0.75±0.11）]比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與AngⅡ組比較，AngⅡ+Prdx-3轉(zhuǎn)染組BNP mRNA [（1.72±0.29）比（1.29±0.15）]和ROS水平[（4439±111）比（3648±254）]明顯下降，但Prdx-3蛋白水平[（0.72±0.14）比（1.89±0.37）]顯著增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論AngⅡ可通過ROS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，而Prdx-3通過降低ROS抑制AngⅡ的作用。

硫氧環(huán)蛋白過氧化物酶3；活性氧；心肌肥大；血管緊張素Ⅱ

高血壓性心臟病主要病理表現(xiàn)是心肌肥大，但持續(xù)性心肌肥大會(huì)導(dǎo)致心力衰竭。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，在血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)的高血壓模型中，心肌組織中活性氧（ROS）水平明顯增高，氧化反應(yīng)被過度激活；增高的ROS通過參與異常的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路或損傷DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等物質(zhì)促進(jìn)細(xì)胞增殖、肥大、凋亡等[1-2]。硫氧環(huán)蛋白過氧化物酶3（Peroxiredoxin-3，Prdx-3）是一種新型過氧化物酶，存在于線粒體，與硫氧還蛋白2（thioredoxin-2，Trx-2）一起清除來自于線粒體的ROS[3]。Prdx-3在多種病理過程中均表達(dá)上調(diào)，以減少組織氧化應(yīng)激損傷[4]。但在高血壓誘導(dǎo)的心肌肥大中，Prdx-3是否可被激活并對(duì)心肌肥大進(jìn)行調(diào)控，目前報(bào)道較少。本研究利用AngⅡ刺激正?；騊rdx-3表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞，通過檢測(cè)腦鈉素（BNP）、ROS和Prdx-3等指標(biāo)的變化，探討Prdx-3在AngⅡ誘導(dǎo)心肌肥大過程中的作用及機(jī)制，為Prdx-3成為靶向治療新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

H9C2大鼠心肌細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)：上海生命科學(xué)研究：）；血管緊張素Ⅱ（Sigma公司產(chǎn)品）；Prdx-3表達(dá)質(zhì)粒（上海吉瑪公司合成）；BNP上下游引物（上海吉瑪公司合成）；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）；SYBR+Tap混合劑（美國(guó)Invitrogen公司）；Prdx-3抗體（美國(guó)Abcam產(chǎn)品）；二氯熒光素二乙酸（Sigma公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

心肌細(xì)胞在含10%胎牛血清濃度的杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）中常規(guī)培養(yǎng)，達(dá)到70%融合后分為四組。①對(duì)照組：以0.4%血清濃度DMEM孵育細(xì)胞；②AngⅡ組：0.4%血清濃度DMEM培養(yǎng)條件下，給予AngⅡ（1×10-6mol/L）孵育細(xì)胞；③AngⅡ+轉(zhuǎn)染對(duì)照組：脂質(zhì)體Lipo 2000將空質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞24 h，0.4%血清濃度DMEM培養(yǎng)12 h（同步化）后，給予AngⅡ（1×10-6mol/L）孵育細(xì)胞；④AngⅡ+Prdx-3轉(zhuǎn)染組：脂質(zhì)體Lipo 2000將Prdx-3表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞24 h，0.4%血清濃度DMEM培養(yǎng)12 h，給予AngⅡ（1×10-6mol/L）孵育細(xì)胞。

1.3 Western blot法檢測(cè)Prdx-3在心肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

各組細(xì)胞同步化后經(jīng)或未經(jīng)AngⅡ刺激30 min，PBS漂洗，細(xì)胞裂解液冰上震蕩裂解30 min后收集裂解細(xì)胞，低溫高速離心15 min，收集上清?？捡R斯亮藍(lán)R-250染色測(cè)定蛋白濃度，每孔50 μg上樣并電泳和轉(zhuǎn)膜。5%牛血清白蛋白封閉1 h，Prdx-3抗體（1∶1000稀釋）4℃孵育過夜。次日，二抗（1∶3000稀釋）室溫孵育2 h后，BCIP/NBT（1∶50稀釋）顯色3 min。Image J軟件對(duì)蛋白表達(dá)條帶進(jìn)行灰度定量分析，以Prdx-3與GAPDH灰度比值作為Prdx-3表達(dá)值。

1.4 Real time PCR法檢測(cè)BNP mRNA表達(dá)[5]

各組細(xì)胞同步化后經(jīng)或未經(jīng)AngⅡ刺激24 h，Trizol提取細(xì)胞總RNA，定量后取0.5 μg RNA行逆轉(zhuǎn)錄。1 μL cDNA進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下：SYRB+Taq混合劑10 μL、Prx-1或GAPDH上下游引物各0.5 μL、cDNA 1 μL、雙蒸水8 μL；擴(kuò)增條件：95℃變性30 s后，95℃變性5 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。BNP上游引物序列5'-TGGGCAGAAGATAGACCGGA-3'，下游引物5'-ACAA CCTCAGCCCGTCACAG-3'；GAPDH上游引物5'-GGC ACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'，下游引物5'-ATGGTG GTGAAGACGCCAGTAA-3'。GAPDH為內(nèi)參照，各組BNP mRNA表達(dá)量以各樣本與對(duì)照組的倍數(shù)表示。

1.5 二氯熒光素二乙酸（DCFH-DA）檢測(cè)ROS水平

DCFH-DA沒有熒光，能自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后被酯酶水解生成還原型二氯熒光素（DCFH），DCFH不能通過細(xì)胞膜，但可被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化生成氧化型二氯熒光素（DCF），DCF可發(fā)出熒光，因此DCF的熒光量可以反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平。本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞同步化后，AngⅡ刺激20 min，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，加入DCFH-DA，終濃度為10 μmol/L，37℃孵育20 min，PBS洗3次，計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞，在熒光酶標(biāo)儀測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm處的熒光強(qiáng)度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Prdx-3表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后Prdx-3蛋白表達(dá)

心肌細(xì)胞（未經(jīng)AngⅡ刺激）經(jīng)空質(zhì)?；騊rdx-3表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后，Western blot檢測(cè)Prdx-3蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染對(duì)照組Prdx-3蛋白表達(dá)值為（0.38±0.05），Prdx-3表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Prdx-3蛋白表達(dá)值為（0.88±0.12），是轉(zhuǎn)染對(duì)照組的2.3倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

2.2 BNP mRNA表達(dá)

與對(duì)照組比較，AngⅡ組BNP mRNA表達(dá)增高[（1.72±0.29）比（1.00±0.00）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；AngⅡ組與AngⅡ+轉(zhuǎn)染對(duì)照組[（1.94±0.34）]比較，BNP mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但AngⅡ+Prdx-3轉(zhuǎn)染組BNP mRNA表達(dá)（1.29±0.15）明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 Western blot法檢測(cè)Prdx-3表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后Prdx-3蛋白表達(dá)

2.3 ROS水平

對(duì)照組熒光強(qiáng)度為（3473±81），AngⅡ組熒光強(qiáng)度為（4439±111），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與AngⅡ組比較，AngⅡ+轉(zhuǎn)染對(duì)照組熒光強(qiáng)度為（4285±167），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但AngⅡ+Prdx-3轉(zhuǎn)染組熒光強(qiáng)度為（3648±254），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 Prdx-3蛋白表達(dá)

對(duì)照組Prdx-3蛋白的表達(dá)值為（0.33±0.05），AngⅡ組Prdx-3蛋白表達(dá)值為（0.72±0.14），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與AngⅡ組比較，AngⅡ+轉(zhuǎn)染對(duì)照組Prdx-3蛋白的表達(dá)值為（0.75±0.11），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但AngⅡ+Prdx-3轉(zhuǎn)染組的Prdx-3蛋白的表達(dá)值為（1.89±0.37），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞Prdx-3蛋白表達(dá)情況

3 討論

ROS包括氧自由基、過氧化物和激發(fā)態(tài)氧等，具有很高的化學(xué)活性。正常時(shí)體內(nèi)ROS的濃度很低，對(duì)機(jī)體具有保護(hù)作用，但過多的ROS可導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、DNA鏈斷裂、蛋白質(zhì)修飾變性，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死[6]。另外，過多ROS還與心肌細(xì)胞肥大密切相關(guān)。研究表明，ROS是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的重要成員，通過激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1/2）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）及核因子κB（NF-κB）等途徑介導(dǎo)多種細(xì)胞因子或活性因子的促心肌細(xì)胞肥大作用[7]。線粒體是心肌細(xì)胞產(chǎn)生ROS的重要場(chǎng)所，主要通過線粒體呼吸鏈電子泄漏產(chǎn)生[3]。最近研究顯示，心臟微環(huán)境內(nèi)的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)還可通過誘導(dǎo)ATP±賴的K+離子通道開放來促進(jìn)線粒體產(chǎn)生更多的ROS，并由此引起Ⅰ型鈉氫交換體和碳酸氫鈉協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的激活，最終引起心肌細(xì)胞肥大[8]。

Peroxiredoxin家族是一種新型的過氧化物酶，Prdx-3是該家族成員中唯一特異性定位于線粒體的酶蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成后經(jīng)過線粒體定位信號(hào)轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體。Prdx-3、Trx2及硫氧還蛋白還原酶2（TrxR2）一起構(gòu)成Prdx-3-Trx-TrxR氧化還原體系，催化來自線粒體的H2O2轉(zhuǎn)變成H2O，從而調(diào)控線粒體內(nèi)H2O2濃度水平，保護(hù)細(xì)胞免于來自線粒體的氧化應(yīng)激[9-10]。有研究顯示，Prdx-3能夠保護(hù)肝癌細(xì)胞免于氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[11]，高表達(dá)Prdx-3在毒物誘導(dǎo)的大鼠海馬區(qū)神經(jīng)損傷中發(fā)揮保護(hù)作用[12]。在本研究中，AngⅡ刺激心肌細(xì)胞30 min后Prdx-3蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，說明AngⅡ能夠上調(diào)心肌細(xì)胞Prdx-3表達(dá)。

本研究利用Prdx-3表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞使心肌細(xì)胞高表達(dá)Prdx-3蛋白，并觀察高表達(dá)Prdx-3對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大和ROS的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AngⅡ使心肌細(xì)胞BNP mRNA的水平增加了1.7倍，Prdx-3表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后BNP mRNA的水平下降了23.5%（P＜0.05），而轉(zhuǎn)染對(duì)照無(wú)明顯變化，提示Prdx-3高表達(dá)能抑制AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。同時(shí)，高表達(dá)Prdx-3對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的ROS也有抑制作用，AngⅡ作用20 min后ROS的表達(dá)量較對(duì)照組明顯增加，Prdx-3表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后ROS水平下降，說明Prdx-3可通過抑制ROS來抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。

綜上所述，AngⅡ可通過ROS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，高表達(dá)Prdx-3通過降低ROS水平來抑制AngⅡ促心肌細(xì)胞肥大作用。因此，Prdx-3有望成為心肌肥大基因治療的新靶點(diǎn)。

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Effect of Peroxiredoxin-3 on angiotensinⅡ-induced cardiomyocytes hypertrophy

ZHAO Xia1LIANG Tingting2PEI Qiang3WANG Hongbo4FANG Yulei2WEI Zhongqiu2FENG Li2SUN Ying2▲
1.Medical Research Center,Jitang College,Hebei United University,Hebei Province,Tangshan063300,China;2.Department of Pathology,Primary Medicine College,Hebei United University,Hebei Province,Tangshan063000,China; 3.Department of Cardiology,Zunhua People's Hospital,Hebei United University,Hebei Province,Tangshan064200, China;4.Department of Surgery,Zunhua People's Hospital,Hebei United University,Hebei Province,Tangshan 064200,China

Objective To study the effect of peroxiredoxin-3(Prdx-3,a noval type of peroxidase)on AngiotensinⅡ(AngⅡ)-induced cardiomyocytes hypertrophy and explore the precious mechanism.Methods Cultured cardiomyocytes (H9C2)were randomly divided into four groups:control group,AngⅡgroup,AngⅡ+vehicle(plasmid without prdx-3 gene)group,AngⅡ+Prdx-3 plasmid group.Prdx-3 was transfected into cardiomyocytes using the liposome infection. Western blot was used to evaluate Prdx-3 expression in cardiomyocytes,while levels of brain natriuretic peptide(BNP) mRNA and reactive oxygen species(ROS)were measured by Real-time PCR and DCFH-DA.Results The expression of Prdx-3 protein in transfected cardiomyocytes(0.88±0.12)was significantly higher than vehicle(0.38±0.05,P＜0.05). Compared with control group,expressions of BNP mRNA,ROS and Prdx-3 in AngⅡgroup all increased[(1.00±0.00) vs(1.72±0.29),(3473±81)vs(4439±111),(0.33±0.05)vs(0.72±0.14),P＜0.05].The difference of expressions of BNP mRNA[(1.72±0.29)vs(1.94±0.34)],ROS[(4439±111)vs(4285±167)]and Prdx-3[(0.72±0.14)vs(0.75±0.11)]between AngⅡand AngⅡ+vehicle groups were not statistically significant(P＞0.05).Compared with AngⅡ,expressions of BNP mRNA and ROS in AngⅡ+Prdx-3 plasmid group were lower[(1.72±0.29)vs(1.29±0.15),(4439±111)vs(3648± 254),P＜0.05],while Prdx-3 level was further higher[(0.72±0.14)vs(1.89±0.37),P＜0.05].Conclusion AngⅡinduced cardiomyocytes to generate ROS,which contributes to cell hypertrophy;however,Prdx-3 over-expression inhibits these changes by decreasing ROS level.

Peroxiredoxin-3;Reactive oxygen species; Cardiomyocytes hypertrophy;AngiotensinⅡ

R542.2

A

1673-7210（2015）07（c）-0018-04

2015-02-14本文編輯：程銘）

河北省引進(jìn)留學(xué)人員科技活動(dòng)項(xiàng)目（D2012003028）。

▲通訊作者