熒光光譜法研究磺脲類降糖藥物與牛血清白蛋白的相互作用

劉家琴,王 坤,聞春雷,李美潔

糖尿病是一種多病因代謝性疾病,其特點(diǎn)是慢性高血糖,伴隨因胰島素分泌及作用缺陷所引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂,亦稱“沉默的殺手”(Silent Killer).中國(guó)在年齡超過(guò)20歲的人群當(dāng)中,糖尿病及糖尿病前期患病率分別達(dá)到9.7%和15.5%,已取代印度成為世界上糖尿病患者最多的國(guó)家[1].

糖尿病分為I型糖尿病、II型糖尿病.中國(guó)市場(chǎng)上臨床口服降糖藥主要有磺脲類、雙胍類、α-葡萄糖苷酶抑制劑、胰島素增敏劑和膳食調(diào)節(jié)劑五類[2].磺脲類藥物有優(yōu)降糖(格列本脲)、美吡噠(格列吡嗪)、達(dá)美康(格列齊特)、糖適平(格列喹酮)、亞莫力(格列美脲)等.研究藥物小分子與蛋白質(zhì)大分子間的作用機(jī)制,有助于了解藥物在體內(nèi)的運(yùn)輸和分布情況,闡明藥物的作用機(jī)制、藥代動(dòng)力學(xué)及藥物的毒副作用.而生物體內(nèi)血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)是血清白蛋白(Serum Albumin),對(duì)生命活動(dòng)有著非常重要的作用,也是運(yùn)輸內(nèi)源及外源性物質(zhì)的重要載體[3].由于牛血清白蛋白(BSA)與人血清白蛋白(HAS)的結(jié)構(gòu)相似,而B(niǎo)SA更價(jià)廉易得,故經(jīng)常被人們作為研究藥物與蛋白質(zhì)間相互作用的理想蛋白質(zhì).熒光光譜法[4-14]是研究蛋白質(zhì)和小分子配體相互作用的一種有效方法,本文運(yùn)用熒光猝滅法研究了模擬生理?xiàng)l件下格列美脲、格列本脲與BSA間的相互作用,所得結(jié)果可為磺脲類降糖藥物在藥代動(dòng)力學(xué)、生命科學(xué)、制藥學(xué)、藥效學(xué)以及臨床醫(yī)學(xué)方面提供參考依據(jù)和指導(dǎo),并為新磺脲類藥物的開(kāi)發(fā)提供一定的參考.格列美脲(Glimepiride)、格列本脲(Glibenclamide)的結(jié)構(gòu)式如下.

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

RF-4500PC型熒光光度計(jì)(Hitachi,日本);微量可調(diào)移液器(Gilson,法國(guó));酸度計(jì)(PHS-10A型,蕭山市科學(xué)儀器廠);超級(jí)恒溫水浴(SYC-15,南京桑立電子設(shè)備廠).

牛血清白蛋白(BSA,上海伯奧生物科技有限公司)儲(chǔ)備液(1.0×10-4mol·L-1),用p H7.40 Tris-HCl緩沖溶液配制,4℃保存于冰箱;格列美脲/格列本脲(中國(guó)藥品生物制品檢定所)儲(chǔ)備液(1.009×10-3mol·L-1/1.028×10-3mol·L-1),用甲醇配制;氯化鈉(AR,1.0 mol·L-1)溶液;實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水;其他試劑均為分析純.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

熒光光譜測(cè)定:依次移取1.0 mol L-1NaCl溶液1.0 m L、適量體積牛血清白蛋白溶液、格列美脲/格列本脲溶液于10 m L比色管中,以p H 7.40 Tris-HCl緩沖溶液定容.在激發(fā)波長(zhǎng)為282 nm條件下掃描300～500 nm范圍的熒光光譜(1 cm石英池、狹縫寬5 nm).

熒光滴定實(shí)驗(yàn):依次移取1.0 mol·L-1的NaCl溶液0.3 m L、一定體積1.0×10-4mol·L-1BSA儲(chǔ)備液、適量p H為7.40的Tris-HCl緩沖溶液于1 cm石英池中(三者體積總和為3.0 m L),逐次加入不同體積的格列美脲/格列本脲儲(chǔ)備液(1.009×10-3mol·L-1/1.028×10-3mol·L-1),格列美脲/格列本脲最終濃度分別為6.727×10-6～3.363×10-5mol·L-1,6.853×10-6～3.427×10-5mol·L-1,反應(yīng)5分鐘后,在激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)(λex/λem)為282 nm/343 nm條件下測(cè)定不同溫度下體系的熒光強(qiáng)度.

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜

圖1為模擬生理?xiàng)l件下BSA、不同濃度的格列美脲/格列本脲與BSA混合后的熒光光譜.

從圖1可以看出:激發(fā)波長(zhǎng)(λex)為282 nm時(shí),BSA的最大發(fā)射波長(zhǎng)(λem)為343 nm,表明BSA的熒光主要來(lái)自色氨酸殘基.固定BSA的濃度,增大格列美脲/格列本脲的濃度,BSA的熒光強(qiáng)度隨藥物濃度的增大有規(guī)律地降低,表明格列美脲/格列本脲通過(guò)猝滅BSA內(nèi)色氨酸殘基的熒光,與BSA發(fā)生相互作用.

2.2 熒光猝滅機(jī)理、結(jié)合常數(shù)

按1.2中描述的熒光滴定實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定了不同溫度(298/297,302,310 K)下體系的熒光強(qiáng)度.根據(jù)修正的Sterm-Volmer方程:

式中F與F0分別代表有和無(wú)猝滅劑時(shí)熒光體的熒光強(qiáng)度,K為Stern-Volmer猝滅常數(shù),f為熒光體的熒光被猝滅的分?jǐn)?shù),[Q]為猝滅劑(格列美脲/格列本脲)的濃度,以F0/(F0-F)對(duì)1/[Q]作圖(如圖2),由直線的斜率和截距可計(jì)算f和K的值(結(jié)果見(jiàn)表1).

圖1 格列美脲/格列本脲-BSA體系的熒光光譜

表1結(jié)果顯示:猝滅常數(shù)隨溫度升高而減小,表明格列美脲/格列本脲對(duì)BSA內(nèi)在熒光的猝滅過(guò)程是靜態(tài)猝滅,猝滅常數(shù)K即是該反應(yīng)的結(jié)合常數(shù).

表1 格列美脲/格列本脲與BSA相互作用的結(jié)合參數(shù)

2.3 格列美脲/格列本脲與BSA的作用力類型

藥物小分子與生物大分子之間的結(jié)合主要借助于靜電作用力、疏水作用力、氫鍵和范德華力,而衡量作用力類型的重要指標(biāo)是反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù).根據(jù)表1中不同溫度下的結(jié)合常數(shù),由van’t Hoff方程:

以ln KT對(duì)作圖,由直線的斜率和截距計(jì)算焓變?chǔ)、熵變?chǔ)值,式中KT為不同溫度的結(jié)合常數(shù),R為氣體常數(shù).而后根據(jù)方程:

可得到自由能ΔG的值,結(jié)果列于表2.

表2 格列美脲/格列本脲與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)

從熱力學(xué)觀點(diǎn)看,一定溫度和壓力下藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)能否自發(fā)進(jìn)行,取決于體系的△G.根據(jù)Ross[15]的觀點(diǎn):△S＜0,△H＜0為氫鍵和范德華力.結(jié)合表2的結(jié)果,推測(cè)格列美脲/格列本脲與BSA的結(jié)合主要依賴于氫鍵和范德華力.

圖2 格列美脲/格列本脲與BSA相互作用的Stern-Volmer圖

3 結(jié)論

采用熒光光譜法研究了磺脲類降糖藥物格列美脲/格列本脲與牛血清白蛋白之間的相互作用.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明格列美脲/格列本脲對(duì)BSA的熒光有猝滅作用,其猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅.根據(jù)不同溫度(298/297,302,310 K)下二者各自與BSA作用的熒光強(qiáng)度,由修正的Stern-Volmer方程計(jì)算了與BSA反應(yīng)的結(jié)合常數(shù),其值分別為2.239×105,1.857×105,1.247×105L·mol-1和1.549×105,0.825 2×105,0.386 5×105L·mol-1;進(jìn)而根據(jù)van’t Hoff方程計(jì)算了反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù),并討論了反應(yīng)的主要作用力類型,其結(jié)果表明二者與BSA間的作用主要為氫鍵和范德華力.

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