消銀1號(hào)對(duì)5%普萘洛爾誘導(dǎo)的豚鼠銀屑病樣模型的病理改變及IL-17A、IL-18的影響

李 欽，劉海剛，祁 燕，葉建州△

(1.云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650011；2.云南省中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650021)

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消銀1號(hào)對(duì)5%普萘洛爾誘導(dǎo)的豚鼠銀屑病樣模型的病理改變及IL-17A、IL-18的影響

李 欽1，劉海剛1，祁 燕2，葉建州2△

(1.云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650011；2.云南省中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650021)

目的 探討消銀1號(hào)治療銀屑病的機(jī)制。方法 使用5%普萘洛爾乳膏外涂豚鼠耳部皮膚，復(fù)制銀屑病樣動(dòng)物模型，48只豚鼠隨機(jī)分為消銀1號(hào)低、中、高劑量組，消銀顆粒組，模型組，空白組，按照既定藥量進(jìn)行灌胃。分別觀察復(fù)制模型1、2、3 周及治療2周后豚鼠的一般情況及雙耳病理切片Baker法評(píng)分及炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)，檢測(cè)各組豚鼠耳組織中IL-17A、IL-18表達(dá)情況。結(jié)果 消銀1號(hào)能改善豚鼠銀屑病樣模型的精神狀態(tài)、飲食等一般情況及紅腫、鱗屑等類(lèi)銀屑病樣外觀；能降低病變組織Baker評(píng)分及炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)，其高、中劑量與消銀顆粒組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。消銀1號(hào)能降低豚鼠銀屑病樣模型局部皮損中IL-17A、IL-18的表達(dá)，其高、中劑量與消銀顆粒組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 消銀1號(hào)能降低普萘洛爾誘導(dǎo)的豚鼠銀屑病樣模型的組織中IL-17A、IL-18的表達(dá)水平。通過(guò)降低細(xì)胞因子IL-17A、IL-18的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)Th17及Th1細(xì)胞的免疫應(yīng)答，可能是消銀1號(hào)治療尋常型銀屑病作用機(jī)理之一。

銀屑??；消銀1號(hào)；豚鼠銀屑病模型；病理改變；IL-17A；IL-18

中醫(yī)將銀屑病(psoriasis)稱(chēng)之為“干癬、白殼瘡、風(fēng)癬、白疕”等，是一種臨床常見(jiàn)的慢性炎癥性和增殖性皮膚病。銀屑病的發(fā)病機(jī)制尚未明確。中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對(duì)銀屑病的認(rèn)識(shí)及治療經(jīng)驗(yàn)極為豐富，近年來(lái)主要是從血熱、血燥、血瘀等幾個(gè)方面進(jìn)行辨證論治，中醫(yī)具有治療方法多樣、用藥?kù)`活、毒副作用小、療效顯著、禁忌癥少、復(fù)發(fā)率低等特點(diǎn)。消銀1號(hào)方來(lái)源于金起鳳教授經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，經(jīng)由導(dǎo)師葉建州主任醫(yī)師根據(jù)云南地域特色及多年臨床經(jīng)驗(yàn)擬定。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)研究消銀1號(hào)對(duì)5%普萘洛爾誘導(dǎo)的豚鼠銀屑病樣模型的病理改變及IL-17A、IL-18的影響，來(lái)探討該方治療銀屑病的可能機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4～5 周齡普通健康成年豚鼠，體重 300～350 g，雌雄不限。許可證號(hào)：Scxk(川)2008-24；合格證號(hào)：0002861。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 消銀1號(hào)(水牛角、金銀花、蒲公英、生地、赤芍、紫草、生地榆、生槐花、苦參、昆明山海棠)流浸膏[1-2]，所有藥物均由云南省中醫(yī)醫(yī)院藥房提供。消銀顆粒(3.5 g×10包，陜西康惠制藥股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字Z0000019)。0.9%氯化鈉注射液，國(guó)藥準(zhǔn)字H52020069，250 mL/瓶；貴州天地藥業(yè)有限責(zé)任公司出品，批號(hào)A13061504。

1.1.3 試劑 5%鹽酸普萘洛爾乳膏由云南中醫(yī)醫(yī)院制劑科制作。IL-17A、IL-18試劑盒(美國(guó)R&B進(jìn)口分裝)。

1.1.4 儀器設(shè)備 低溫高速離心機(jī)(美國(guó) Thermo Scientific)、石蠟切片機(jī)(Leica RM2235 型)、光學(xué)顯微鏡(德國(guó)，DFC310FX)、超低溫冰箱(美國(guó) Thermo)、蒸發(fā)儀(EYEL4QSB-2100)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 預(yù)實(shí)驗(yàn) 12只豚鼠分2組，即空白、模型，每組6只。模型組按照文獻(xiàn)法[3]，使用 5%普萘洛爾乳劑(云南省中醫(yī)醫(yī)院制劑室配制)均勻涂于雙側(cè)耳背，面積1 cm2，厚度1 mm。1 日 4 次，共 3 周；空白組涂以 5%普萘洛爾乳劑相同的基質(zhì)，用法同前。預(yù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖球?yàn)證復(fù)制豚鼠銀屑病模型是否成功。

①一般情況：分別觀察造模 1、2、3 周后，豚鼠的精神、反應(yīng)、毛發(fā)光澤度、飲食、二便、體重等情況變化。造模組動(dòng)物出現(xiàn)：精神差，反應(yīng)遲鈍，喜靜，進(jìn)食量減少，體重下降，毛色變暗、易脫。

②豚鼠雙耳形態(tài)：分別觀察造模 1、2、3 周后，豚鼠雙耳毛發(fā)有無(wú)脫落、局部皮膚有無(wú)紅腫、皮溫是否增高、表面有無(wú)銀白色鱗屑，豚鼠對(duì)刺激部位有無(wú)搔抓動(dòng)作等情況變化。所有造模動(dòng)物耳部涂藥處出現(xiàn)：毛發(fā)逐漸脫落，局部皮膚紅腫，皮溫升高，表面覆有薄層銀白色鱗屑，豚鼠對(duì)刺激部位有搔抓動(dòng)作。2～3 周后紅腫加重，鱗屑脫落明顯，刮之有出血(見(jiàn)下圖)。

③通過(guò)切片觀察病理改變。參照Baker 評(píng)分法[4]。方差分析結(jié)果表明空白組和模型組的 Baker 評(píng)分和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)之間具有顯著差異(P<0.05)，綜合前二項(xiàng)指標(biāo)判定模型復(fù)制成功(見(jiàn)下圖)。

1.2.2 動(dòng)物分組、復(fù)制模型 新進(jìn)的豚鼠48只飼養(yǎng)一周，雌雄分開(kāi)，待其狀態(tài)良好，適應(yīng)飼養(yǎng)室環(huán)境后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分為 6 組：消銀1號(hào)低、中、高劑量組，消銀顆粒組，模型組，空白組，每組8只。除空白組豚鼠外，其余6組都用 5%普萘洛爾乳膏均勻涂于雙側(cè)耳背，面積1 cm2，厚度 1 mm。1日4次，共3周[4]；空白組涂以相同的基質(zhì)，用法同前。

1.2.3 給藥 復(fù)制模型成功后，開(kāi)始分組給藥。所有組別按照豚鼠體重每100 g灌胃藥總量0.5 mL配制，低劑量組劑量：3.85 g生藥/kg；中劑量組劑量：7.75 g生藥/kg；高劑量組劑量：15.5 g生藥/kg；消銀顆粒組：0.8 g/kg；空白組和模型組按照豚鼠體重灌服同等體積的生理鹽水。1 日1 次，共 2 周。每隔 3天量體重 1 次，調(diào)整給藥量。

1.2.4 取材及材料初處理 治療 2 周后取材。具體方法為：10%水合氯醛麻醉數(shù)分鐘，即取雙側(cè)耳組織。右側(cè)耳組織用 10%甲醛溶液固定。左側(cè)耳組織置于﹣80℃冰箱保存，待組織勻漿后進(jìn)行 IL-17、IL-18檢測(cè)。

1.2.5 指標(biāo)檢測(cè) a.一般情況：具體參照預(yù)實(shí)驗(yàn)。b.豚鼠雙耳形態(tài)：具體參照預(yù)實(shí)驗(yàn)。c.普通病理制片 HE 染色：將用 10%甲醛溶液固定的耳廓皮膚標(biāo)本，用水浸泡，多次更換水，2h 后脫水，石蠟包埋，切片，HE 染色，中性樹(shù)膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察病理改變，每組豚鼠雙側(cè)耳組織各作切片 2張，用光鏡在 10×20 視野下觀察并攝圖(通過(guò)血球記數(shù)盤(pán)校正圖片的面積)，分別隨機(jī)選取 5 個(gè)視野，對(duì)選中視野進(jìn)行 Baker 法評(píng)分[3]及炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)。

d檢測(cè)各組豚鼠耳組織中IL-17、IL-18表達(dá)情況。切取留存標(biāo)本200 g，放入有1 mL預(yù)冷生理鹽水的玻璃勻漿管內(nèi)，手工勻漿20 min，勻漿后以3500 r/min離心15 min，吸取上清液，采用ELISA法(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法)檢測(cè)豚鼠耳組織中IL-17、IL-18含量，操作過(guò)程按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

4 結(jié)果

4.1 一般情況 除空白組外所有動(dòng)物出現(xiàn)：精神差，反應(yīng)遲鈍，喜靜，進(jìn)食量減少，體重下降，毛色變暗、易脫。經(jīng)治療 2 周后給藥組上述癥狀不同程度減輕。

4.2 豚鼠雙耳形態(tài) 出空白組外耳部涂藥處出現(xiàn)：毛發(fā)逐漸脫落，局部皮膚紅腫，皮溫升高，表面覆有薄層銀白色鱗屑，豚鼠對(duì)刺激部位有搔抓動(dòng)作。2～3 周后紅腫加重，鱗屑脫落明顯，刮之有出血(詳見(jiàn)附圖)。治療用藥 2 周后，模型組變化不明顯，其它各給藥組癥狀不同程度發(fā)生變化明顯。

4.3 病理組織Baker 法評(píng)分及炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 見(jiàn)表1、表2。

表1 各組Baker法評(píng)分

注：經(jīng)Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)分析：6組間比較，P=0.004<0.05，說(shuō)明六組間有顯著性差異；再經(jīng)Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較：與模型組比：**P=0.000<<0.01；消1中組與消1高組比，P=0.071>0.05；與消1中組比較：▲▲P=0.000<0.01；消銀顆粒組與消1低組比較，P=1.71>0.05.

表2 各組炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)

注：經(jīng)Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)分析：6組間比較，P=0.004<0.05，說(shuō)明6組間有顯著性差異；再經(jīng)Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較：與模型組比較：**P=0.000<0.01；消1中組與消1高組比較，P=0.053>0.05；消1低組與消1中組比較，P=0.073>0.05；消銀顆粒組與消1低組比較，P=0.620>0.05。

4.4 豚鼠銀屑病模型耳組織勻漿后IL-17A、IL-18含量結(jié)果 見(jiàn)表3、4。

表3 耳組織IL-17A含量測(cè)定

注：經(jīng)Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)分析：6組間比較，P=0.000<0.05，說(shuō)明6組間有顯著性差異；再經(jīng)Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較：與模型組比較：**P=0.000<0.01；消1中組與消1高組比較，P=0.535>0.05；與消1中組比較：▲▲P=0.001<0.01；消銀顆粒組與消1低組比較，P=0.318>0.05。

表4 耳組織IL-18含量測(cè)定

注：經(jīng)Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)分析：6組間比較，P=0.000<0.05，說(shuō)明6組間有顯著性差異；再經(jīng)Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較：與模型組比較：**P=0.000<0.01；消1中組與消1高組比較，P=0.353>0.05；與消1中組比較：▲▲P=0.001<0.01；消銀顆粒組與消1低組比較，P=0.710>0.05。

5 討論

目前認(rèn)為，銀屑病是多基因遺傳背景下T細(xì)胞失常的免疫性疾病[5]。皮膚組織病理中浸潤(rùn)的T淋巴細(xì)胞在其發(fā)病中扮演了重要的角色。T淋巴細(xì)胞針對(duì)不同抗原，分泌各種細(xì)胞因子，經(jīng)過(guò)相應(yīng)免疫反應(yīng)，最終導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、角化不全、表皮突延長(zhǎng)、顆粒層消失、炎癥浸潤(rùn)及微血管形成。IL-17是Th17細(xì)胞分泌的一種前炎癥細(xì)胞因子，可促使機(jī)體產(chǎn)生趨化因子，促使單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞大量增殖，誘導(dǎo)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生多種抗菌肽及細(xì)胞因子，增強(qiáng)局部炎癥。在自身免疫性疾病和炎癥性疾病中，Th17細(xì)胞通過(guò)分泌IL-17、IL-22、IL-6等炎癥因子介導(dǎo)免疫損傷，其中IL-17是Th17細(xì)胞的標(biāo)志性細(xì)胞因子[6-7]。在銀屑病患者的皮損處和外周血中均發(fā)現(xiàn)有Th17細(xì)胞的存在，且隨著病情活動(dòng)IL-17mRNA的表達(dá)水平會(huì)增高[8]。IL-17A作為其代表性成員，常被認(rèn)為等同于IL-17，因其臨床檢測(cè)靈敏度最高而成為了該家族中研究最為深入的成員。IL-18屬炎癥前細(xì)胞因子，主要由巨噬細(xì)胞T、B淋巴細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生?？梢源龠M(jìn)Thl細(xì)胞增殖和分化，刺激Thl細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ。增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性，表現(xiàn)為T(mén)hl型免疫反應(yīng)，同時(shí)在一定條件下，又能促進(jìn)Th2型免疫反應(yīng)，對(duì)多種免疫活性細(xì)胞有著直接或間接的調(diào)節(jié)功能，在系統(tǒng)性或局部炎癥中起重要作用。IL-18在尋常性銀屑病的起病及其慢性炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。尋常性銀屑病患者皮損及血清中IL-18明顯高于正常人[9]。提示來(lái)源于角質(zhì)形成細(xì)胞的IL-18參與了尋常性銀屑病局部的Thl免疫反應(yīng)。已有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)尋常性銀屑病患者外周血中IL-17及IL-18的表達(dá)明顯要高于正常健康人群，且進(jìn)展期表達(dá)明顯要高于靜止期，IL-17及IL-18在尋常性銀屑病患者外周血中的表達(dá)與PSAI評(píng)分也呈正相關(guān)[10]。

消銀1號(hào)由水牛角、金銀花、蒲公英、生地、赤芍、紫草、生地榆、生槐花、苦參、昆明山海棠組成，來(lái)源于金起鳳教授經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，經(jīng)由導(dǎo)師某教授根據(jù)云南地域特色及多年臨床經(jīng)驗(yàn)擬定。綜合全方，有清熱涼血活血、解毒止癢退疹之功。經(jīng)現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，該方諸多藥物合用，共有抗炎、抗過(guò)敏、降低毛細(xì)血管通透性、抑制表皮細(xì)胞增殖、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等功能。

消銀1號(hào)能改善豚鼠銀屑病模型的精神狀態(tài)、飲食等一般情況及紅腫、鱗屑、瘙癢等類(lèi)銀屑病樣外觀；能明顯降低普萘洛爾誘導(dǎo)的豚鼠銀屑病樣模型的組織Baker評(píng)分及炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)，能改善該模型的組織病理學(xué)形態(tài)；能降低5%普萘洛爾誘導(dǎo)的豚鼠銀屑病樣模型的組織中IL-17A、IL-18的表達(dá)水平。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，我們考慮通過(guò)降低細(xì)胞因子IL-17A、IL-18的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)Th17及Th1細(xì)胞的免疫應(yīng)答，可能是消銀1號(hào)治療尋常型銀屑病血熱證作用機(jī)理之一。

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Pathological Changes of 5% Propranolol Induced Guinea Pig Model and Effect of IL-17A and IL-18 Caused byXiaoyinNo. 1

LI Qin1, LIU Hai-gang1, QI Yan2, YE Jian-zhou2

(1.YunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Kunming650500,Yunnan;2.YunnanProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Kunming650021,Yunnan)

Objective: To study the mechanism ofXiaoyinNo. 1 in the treatment of psoriasis. Methods: 5% propranolol cream was used to coat ear skin of guinea pigs to copy psoriasis-like animal model. 48 guinea pigs were randomly divided into low, medium and high dose groups ofXiaoyinNo. 1, aXiaoyingranule group, a model group and a control group and were given intragastric administration in accordance with established dose. The copy model guinea pigs were observed in the 1st, 2nd and 3rd week and after a 2-week treatment, the general conditions, ears pathological section Baker score and inflammatory cell counts were observed and IL-17A and IL-18 presentation of guinea pigs ear tissue of each group were detected. Results:XiaoyinNo. 1 could improve the mental state and diet of the psoriasis guinea pigs as well as their redness, scaling and other types of psoriasis-like appearance and reduced Baker score and inflammatory cell counts. The medium and high dose groups were statistically significant (P<0.05) when compared withXiaoyingranule group.XiaoyinNo. 1 could reduce the IL-17A and IL-18 presentation in the local lesions of the psoriasis guinea pigs and the medium and high dose groups were statistically significant (P<0.05) when compared withXiaoyingranule group. Conclusions:XiaoyinNo.1 can reduce the IL-17A and IL-18 presentation of the propranolol-induced psoriasis-like guinea pigs. By decreasing the presentation of IL-17A and IL-18 cytokines to regulate Th17 and Th1 cells in the immune response, it may be one of mechanisms ofXiaoyinNo. 1 to cure psoriasis vulgaris.

psoriasis,XiaoyinNo.1, psoriasis guinea pig model, pathology, IL-17A, IL-18

李欽(1987～)，女，湖北，研究方向：皮膚病的防治研究，E-mail：510429151@ qq.com

△通信作者：葉建州，E-mail：kmyjz63@sina.com.

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2015-07-06)