新型酰基脲類Raf激酶抑制劑的合成及其抗腫瘤活性

祝 宇，華濤濤，，趙硯瑾，江發(fā)龍，姚鄭林，陳曉東，李庶心

(1.江西中醫(yī)藥大學研究生部，江西南昌 330006;2.軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所，北京 100850)

分子靶向療法是治療惡性腫瘤最有效的方式之一［1］。Raf激酶介導的 Ras/Raf/MEK/ERK 通路與腫瘤產(chǎn)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)，其抑制劑成為抗腫瘤藥物研究的熱點［2－3］，如拜耳公司和ONYX公司聯(lián)合研制的多靶點新藥——索拉非尼。雖然索拉非尼抗腫瘤效果較好［4］，但有許多不良反應，如手足綜合征、疲乏、腹瀉、皮疹、高血壓、脫發(fā)和食欲下降等［5］尋找活性更高、副作用更小的新型抗腫瘤藥物，具有重要意義。

本文通過分析索菲拉尼的分子結(jié)構(gòu)，結(jié)合國外專利［6］，設(shè)計了新Raf激酶抑制劑結(jié)構(gòu):(1)保留吡啶環(huán)，形成氫鍵;(2)以咪唑基替代甲酰胺基，增加氫鍵結(jié)合點，增強結(jié)構(gòu)剛性;(3)在咪唑基上引入大基團(如三氟甲基)，增強抑制活性;(4)在結(jié)合區(qū)引入氟原子，增強代謝穩(wěn)定性。

Scheme 1

基于以上設(shè)計理念，本文以4-氯吡啶甲酸為原料，經(jīng)6步反應制得中間體——取代基-4-【{2-［5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基］吡啶-4-基}氧基】苯胺(7);7分別與取代苯甲?；惲蚯杷狨?8a～8e)反應，合成了6個新型的?；孱怰af激酶抑制劑(9a～9f，Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和ESI-MS表征。用MTT法考察了9a～9f對人胃癌細胞株(BGC823)的抑制活性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

RY-1型熔點儀(溫度未校正);JNM-ECA-400 MHz型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標);LCQ-Advantage-Max型質(zhì)譜儀。

4-氯-2-吡啶甲酰氯鹽酸鹽(1)按文獻［6］方法合成;其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1)4-氯-2-吡啶甲酰胺(2)的合成

在三口瓶中加入25%氨水溶液10 mL，攪拌下于＜－5℃滴加1 0.6 g(2.8 mmol)的二氯甲烷(8 mL)溶液(0.5 h)，滴畢，于 ＜10 ℃反應1 h(TLC 檢測)。過濾，濾餅用水(3×50 mL)洗滌，干燥得淡黃色固體2 0.43 g，收率96.9%，m.p.167 ℃ ～169 ℃。

(2)4-氯-2-吡啶甲腈(3)的合成

在反應瓶中加入2 0.4 g(2.6 mmol)，三乙胺(TEA)7 mL和干燥乙酸乙酯40 mL，攪拌使其溶解;于＜－5℃滴加三氟乙酸酐1 mL(40 min)，滴畢，于常溫反應0.5 h(TLC檢測)。加入10%碳酸鉀溶液50 mL，用乙酸乙酯(3×50 mL)萃取，合并有機層，用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮得白色固體3 0.33 g，收率93.3%，m.p.84 ℃ ～86 ℃。

(3)5a和5d的合成(以5a為例)

在反應瓶中加入3 0.32 g(2.3 mmol)，N-(3-氟-4-羥基苯酚)乙酰胺(4a)0.53 g(3.2 mmol)，碳酸鉀0.55 g和干燥DMF 30 mL，攪拌使其溶解;于80℃反應5 h(TLC檢測)。加水50 mL，過濾，濾餅用水(3×50 mL)洗滌，干燥得白色固體N-［4-(2-氰基吡啶-4-氧基)-3-氟苯基］乙酰胺(5a)0.53 g，收率85.1%，m.p.162 ℃ ～165 ℃。

以4d替代4a，用類似的方法合成白色固體N-{4-［(2-氰基吡啶-4-基)氧基］苯基}乙酰胺(5d)，收率80.2%，m.p.174 ℃ ～176 ℃。

(4)6a和6d的合成(以6a為例)

在反應瓶中加入5a 0.31 g(1.1 mmol)和正丙醇20 mL，攪拌使其溶解;加入甲醇鈉 0.1 g(1.9 mmol)，于50 ℃反應3 h。加入乙酸銨0.38 g(6.0 mmol)，于 70 ℃反應1 h。加入3-溴-1，1，1-三氟丙酮0.35 mL，于85℃反應20 h(TLC檢測)。加水50 mL，用乙酸乙酯(3×50 mL)萃取，合并有機層，用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液蒸干，殘余物經(jīng)硅膠柱層析［洗脫劑A:V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=2 ∶1］純化得淡黃色固體 N-【3-氟-4-{2-氟-3-［5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基］苯氧基}苯基】乙酰胺(6a)0.36 g，收率 82.5%，m.p.183 ℃ ～ 186 ℃(187 ℃ ～189 ℃［7］)。

以5d替代5a，用類似的方法合成淡黃色固體N-【4-【{2-［5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基］吡啶-4-基}氧基】苯基】乙酰胺(6d)，收率 79.8%，m.p.182 ℃ ～184 ℃(182℃ ～184℃［7］)。

(5)7a和7d的合成(以7a為例)

在反應瓶中加入6a 0.35 g(0.92 mmol)和2 mol·L－1H2SO410 mL，攪拌下于 85 ℃ 反應 5 h(TLC檢測)。用50%氫氧化鈉溶液調(diào)至pH呈堿性。過濾，濾餅用水(3×20 mL)洗滌，干燥得紅褐色固體 3-氟-4-【{2-［5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基］吡啶-4-基}-氧基】苯胺(7a)0.28 g，收率88.4%，m.p.172 ℃ ～175 ℃。

以6d替代6a，用類似的方法合成紅褐色固體4-【{2-［5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基］吡啶-4-基}氧基】苯胺(7d)，收率84.6%，m.p.165 ℃ ～167 ℃。

(6)9a～9f的合成(以9a為例)

在反應瓶中加入 7a 0.12 g(0.35 mmol)，無水乙腈10 mL和3，5-二(三氟甲基)苯甲酰基異硫氰酸酯(8a)0.16 g(0.54 mmol)，攪拌下于室溫反應5 h(TLC檢測)。減壓濃縮，殘余物用水100 mL溶解，用乙酸乙酯(3×30 mL)萃取，合并有機層，用無水硫酸鎂干燥;抽濾，濾液濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:A=1∶3)純化得白色固體9a 0.14 g。

用類似的方法合成白色固體9b～9f。

N-【3-氟-4-{2-［5-(三氟甲基)-1H-咪 唑-2-基］吡啶-4-氧基}】-3，5-二三氟甲基苯甲酰硫脲(9a):收率 63.9%，m.p.178℃ ～180℃;1H NMR δ:7.13 ～7.15(dd，J=4.0 Hz，4.0 Hz，1H)，7.40 ～7.41(d，J=4.0 Hz，1H)，7.47 ～7.70(m，4H)，7.89(m，1H)，8.00 ～8.02(m，3H)，8.57 ～8.58(d，J=4.0 Hz，1H)，10.66(s，1H)，13.60(s，1H);ESI-MS m/z:637{［M+H］+}。

N-【3-氟-4-{2-［5-(三氟甲基)-1H-咪 唑-2-基］吡啶-4-氧基}苯基】苯基乙酰硫脲(9b):收率62.7%，m.p.191 ℃ ～194 ℃;1H NMR δ:3.83(s，2H)，7.11 ～7.13(dd，J=4.0 Hz，4.0 Hz，1H)，7.28 ～ 7.56(m，8H)，7.88(s，1H)，7.99 ～8.03(dd，J=4.8 Hz，1H)，8.57 ～8.59(d，J=4.0 Hz，1H)，11.84(s，1H)，12.50(s，1H)，13.60(s，1H);ESI-MS m/z:515{［M+H］+}。

N-【3-氟-4-{2-［5-(三氟甲基)-1H-咪 唑-2-基］吡啶-4-氧基}苯基】-4-氯苯甲酰硫脲(9c):收率 68.5%，m.p.199 ℃ ～203 ℃;1H NMR δ:7.09 ～ 7.11(dd，J=4.0 Hz，4.0 Hz，1H)，7.40 ～ 7.56(m，4H)，7.88(d，J=5.0 Hz，1H)，8.17 ～8.20(d，J=6.0 Hz，1H)，8.31(s，1H)，8.55 ～8.58(m，4H)，12.21(s，1H)，13.59(s，1H);ESI-MS m/z:535{［M+H］+}。

N-【4-{2-［5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基］吡啶-4-氧基}苯基】-3-(吡啶-3-基)丙烯酰硫脲(9d):收率 69.4%，m.p.198 ℃ ～201℃;1H NMR δ:7.70 ～7.11(dd，J=2.0 Hz，2.0 Hz，1H)，7.16 ～7.20(d，J=8.0 Hz，1H)，7.31 ～7.33(d，J=4.0 Hz，2H)，7.46 ～ 7.47(d，J=4.0 Hz，1H)，7.52 ～ 7.54(dd，J=4.0 Hz，4.0 Hz，1H)，7.88 ～ 7.86(m，4H)，8.03 ～ 8.05(dd，J=4.0 Hz，4.0 Hz，1H)，8.56 ～8.58(d，J=4.0 Hz，1H)，8.63 ～ 8.64(dd，J=2.0 Hz，2.0 Hz，1H)，8.85 ～8.86(d，J=4.0 Hz，1H)，11.67(s，1H)，12.67(s，1H)，13.55(s，1H);ESI-MS m/z:510{［M+H］+}。

N-【3-氟-4-{2-［5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基］吡啶-4-氧基}苯基】-2-甲氧基苯甲酰硫脲(9e):收率67.3%，m.p.197 ℃ ～200 ℃;1H NMR δ:7.08 ～7.22(m，3H)，7.42 ～7.64(m，6H)，7.78(m，1H)，7.95 ～8.01(dd，J=10.0 Hz，6.0 Hz，1H)，8.56 ～8.57(d，J=4.0 Hz，1H)，10.45 ～10.53(d，J=12.0 Hz，1H)，13.57(s，1H);ESI-MS m/z:531{［M+H］+}。

N-【4-{2-［5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基］吡啶-4-氧基}苯基】-3，5-二三氟甲基苯甲酰硫脲(9f):收率 60.8%，m.p.187℃ ～190℃;1H NMR δ:5.76(s，1H)，7.11 ～ 7.13(dd，J=4.0 Hz，4.0 Hz，1H)，7.32 ～ 7.34(d，J=4.0 Hz，2H)，7.43 ～ 7.45(d，J=8.0 Hz，1H)，7.87 ～7.94(d，J=10.0 Hz，3H)，8.41(s，1H)，8.56 ～8.57(d，J=4.0 Hz，1H)，8.63(m，2H)，10.82(s，1H)，13.58(s，1H);ESI-MS m/z:619{［M+H］+}。

1.3 抗腫瘤活性測試［8－9］

在培養(yǎng)皿中，將人胃癌細胞株BGC823接種于含10%胎牛血清的RPMI1640細胞培養(yǎng)液中，分別補充青霉素100 ku·L－1和鏈霉素100 ku·L－1;培養(yǎng)皿于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d～3 d離心換液一次并傳代和收集細胞。

收集對數(shù)生長期細胞。用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配制為所需濃度的細胞懸液，按3 000個細胞(100 μL)/孔接種到96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)12 h后每孔分別加入濃度為200 μL·mL－1，20 μL·mL－1和 2 μL·mL－1的受試品 100 μL，使終濃度分別為 100 μL·mL－1，10 μL·mL－1和 1 μL·mL－1。每組 3 個平行孔，以索拉非尼為對照組，培養(yǎng)72 h～120 h。棄去上清液，每孔加入20 μL新鮮配制的5 mg·mL－1MTT試劑，于37℃培養(yǎng)4 h;在3 000 rpm·min－1下離心，棄去上清液。用DMSO 200 μL溶解甲臜，渦旋振蕩1 min后，用酶標儀于570 nm/450 nm波長下測定OD值并計算抑制率［抑制率=(OD對照－OD藥液)/OD對照×100%］，結(jié)果見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

相對于文獻［6］，本文路線有以下優(yōu)點:(1)反應條件溫和，收率提高;(2)環(huán)合反應生成三氟甲基咪唑，只需加水即可析出固體，后處理過程大大簡化，縮短了反應時間。

2.2 抗腫瘤活性

表1為9a～9f的抗腫瘤活性。由表1可見，9c和9d對BGC823的抑制率與索拉非尼(SLN)接近，抗腫瘤活性較好。在用藥量為100 μg時，9c和9d的抑制率分別為66.86%和63.60%。

表1 9a～9f對BGC823的抑制活性*Table 1 Inhibition rate of 9a～9f against BGC823

3 結(jié)論

合成了6個新型的?；孱怰af激酶抑制劑(9a～9f)。體外抗腫瘤活性結(jié)果表明:N-【3-氟-4-{2-［5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基］吡啶-4-氧基}苯基】-4-氯苯甲酰硫脲(9c)和 N-【4-{2-［5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基］吡啶-4-氧基}苯基】-3-(吡啶-3-基)丙烯酰硫脲(9d)的抑制活性較好，與索拉非尼藥效接近，可作為候選藥作進一步研究。

［1］廖昌軍，袁立華，蔣慶琳.骨靶向抗腫瘤藥物中間體N-Boc-N'-3，3-雙(二乙氧膦酰基)丙基甘氨酰胺的合成［J］.合成化學，2012，20(2):254 －256.

［2］張向陽，劉章琴，陳元偉.新型喹唑啉類酪氨酸激酶化學抑制劑的設(shè)計與合成［J］.合成化學，2009，17(2):199－202.

［3］焦宇，陸濤.抗腫瘤藥物Raf激酶抑制劑的研究進展［J］.海峽藥學，2007，19(8):1－5.

［4］周愛萍，孫燕.多靶點抗腫瘤新藥索拉非尼的研究進展［J］.癌癥進展雜志，2006，4(6):529 －533.

［5］Clark J W，Eder J P，Ryan D，et al.Safety and pharmacokinetics of the dual action Raf kinase and vascular endothelial growth factor receptor inhibitorBAY 43-9006，in patients with advanced，refractory solid tumors［J］.Clin Cancer Res，2005，11(15):5472.

［6］Aikawa M E，Amiri P，Dove J H，et al.Substituted benzimidazoles as kinase inhibitors［P］.US WO 2007 030 377，2007.

［7］Zhan W H，Li Y Y，Huang W P，et al.Design，synthesis and antitumor activities of novel bis-aryl ureas derivatives as Raf kinase inhibitors［J］.Bioorganic and Medicinal Chemistry，2012，20(14):4323 －4329

［8］Kupsch P，Henning B F，Passarge K，et al.Results of a phaseⅠtrial of sorafenib(BAY 43-9006)in combination with oxaliplatin in patients with re fractory solid tumors，including colorectal cancer［J］.Clin Colorectal Cancer，2005，5(3):188

［9］黃秀華，張丹.紅毛氈提取物體外抗腫瘤的實驗研究［J］.四川生理科學雜志，2009，31(4):149 －150