姜黃素衍生物C085對K562細(xì)胞的作用及機制研究

吳　鶯，陳瑞家，吳麗賢，許建華

(福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院1.福建省天然藥物藥理學(xué)重點實驗室、2.天然藥物學(xué)系，福建福州　350108)

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姜黃素衍生物C085對K562細(xì)胞的作用及機制研究

吳鶯1，2，陳瑞家1，吳麗賢1，許建華1

(福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院1.福建省天然藥物藥理學(xué)重點實驗室、2.天然藥物學(xué)系，福建福州350108)

摘要:目的研究姜黃素衍生物C085對K562細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探討其作用機制。方法采用MTT法觀察C085對細(xì)胞增殖的影響; Annexin V-FITC/PI雙熒光染色后流式細(xì)胞儀檢測C085對細(xì)胞凋亡的影響;蛋白免疫印跡探討C085引發(fā)K562細(xì)胞凋亡的機制，檢測其對BCR-ABL及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白的磷酸化及對其他凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響; JC-1熒光染色法檢測C085對細(xì)胞線粒體膜電位的影響。結(jié)果C085在低濃度下抑制K562細(xì)胞，IC(50)只有其母體姜黃素的1/5甚至更低;在24h即對K62細(xì)胞有較強的誘導(dǎo)凋亡作用，主要是中、晚期凋亡。與陽性對照藥IM相比，誘導(dǎo)凋亡作用明顯。對其作用機制研究發(fā)現(xiàn)，C085可下調(diào)BCR-ABL的自磷酸化和下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白Stat 5 和Crkl的磷酸化水平，作用均強于IM。JC-1熒光染色法結(jié)果表明，C085通過直接作用于線粒體的PT孔使其開放，下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Bax，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促凋亡作用強于IM。結(jié)論C085可抑制BCR-ABL+K562細(xì)胞的生長，與其抑制BCR-ABL蛋白激酶活性，下調(diào)相關(guān)信號通路;直接作用于線粒體的PT孔使其開放，激活凋亡相關(guān)蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞:C085;姜黃素; IM; BCR-ABL;增殖;凋亡;機制

慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是發(fā)生于造血干細(xì)胞的血液系統(tǒng)惡性克隆增生性疾病，以t(9;22) (q34; q11)染色體易位形成的斷裂點簇集區(qū)(breakpoint cluster region，BCR)-艾貝爾遜白血病病毒(Abelson leukemia virus，ABL)融合基因為主要標(biāo)志，約95 %的CML患者可檢出。bcr-abl融合基因表達(dá)的BCR-ABL蛋白具有持續(xù)活化、不受機體調(diào)控的酪氨酸激酶活性，并活化細(xì)胞內(nèi)相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而調(diào)控細(xì)胞的分裂與增殖，與CML的發(fā)病機制密切相關(guān)，是CML治療的重要分子靶點［1－2］。目前，酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)已成為抗癌研究的熱點，以PTK為靶點的抗癌藥物研發(fā)受到世界各大制藥集團的重視。

伊馬替尼(imatinib，IM)又稱格列衛(wèi)(STI571)，是最具代表性的第一代TKI，在靶向治療CML上取得了巨大的成功。但其治療后易復(fù)發(fā)［3］。產(chǎn)生耐藥原因主要有Bcr-Abl激酶點突變、Bcr-Abl基因的擴增、Bcr-Abl蛋白濃度的增加、mdr-1基因及其產(chǎn)物P-gp的過表達(dá)，以及白血病干細(xì)胞對IM不敏感等［4－6］。目前，以達(dá)沙替尼和尼羅替尼為代表的第2代BCR-ABL酪氨酸激酶抑制劑已經(jīng)上市。目前正在開發(fā)的主要有: MK-0457、伯舒替尼、INNO-406、AZD053、AP系列、PD系列等。

姜黃素(curcumin，Cur)是從姜科植物姜黃中提取的一種植物多酚，具有降血脂、抗突變、抗癌、抗氧化等生理功能［7］，其價格低廉、用藥安全等特點而引起眾多研究者的關(guān)注。然而，Cur存在水溶性差，水溶液易水解，首過消除現(xiàn)象明顯，生物利用度低等問題，這些因素都阻礙了其應(yīng)用于腫瘤治療［8］。而通過結(jié)構(gòu)修飾獲得Cur的衍生物及類似物是提高生物利用度的好方法［9］。近年來，國內(nèi)外多個研究小組和機構(gòu)對Cur進行結(jié)構(gòu)改造和修飾，合成了一系列的Cur衍生物。本實驗室也在這方面做了大量工作和研究。

C085是本實驗室利用拼合原理合成的Cur衍生物(Fig 1A)，我們對其與BCR-ABL激酶的結(jié)合進行了計算機模擬，發(fā)現(xiàn)和IM與BCR-ABL激酶的結(jié)合模式完全不同。本文以K562細(xì)胞為模型，對Cur衍生物C085的體外抗慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞活性進行初步評價及探討。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品與試劑姜黃素及姜黃素衍生物C085由本課題組合成并純化，經(jīng)質(zhì)譜驗證、HPLC分析鑒定，純度為95%以上; RPMI l640培養(yǎng)基(Hyclone，Australia) ;新生牛血清(杭州四季青公司) ;人全血CD34+分選試劑盒(Stem Cell Technologies，Vancouver，Canada) ; AnnexinV細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、JC-1線粒體凋亡檢測試劑盒、蛋白定量檢測試劑盒(南京凱基生物發(fā)展有限公司) ; MTT(Sigma USA) ; Phospho-c-Abl，Phospho-Stat5 and Phospho-CrkL Multiplex Western Detection Cocktail、Bax、Bcl-2、β-actin (Cell signaling Technology，USA) ; DMSO (Sigma-Aldrich，USA) ;蛋白分子Marker(Bio-Rad，USA) ; ECL熒光底物(Amersham，USA) ;其它試劑均為進口分裝分析純。

1.1.2主要儀器5%CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher，美國) ;免疫印跡成像系統(tǒng)(Carestream，加拿大) ;倒置顯微鏡(Olympus，日本) ;流式細(xì)胞儀(BD美國) ;酶標(biāo)儀(Thermo Fisher，美國) ;臺式高速冷凍離心機(Beckman，美國) ; 6孔培養(yǎng)板(Corning，德國)。

1.1.3細(xì)胞株及培養(yǎng)方法K562購自中科院上海細(xì)胞所，為人慢性粒細(xì)胞白血病(CML)急變細(xì)胞系，穩(wěn)定表達(dá)BCR-ABL蛋白。用RPMI 1640+10%胎牛血清+雙抗(1×105IU·L－1青霉素+ 100 mg ·L－1鏈霉素)培養(yǎng)于37℃，5% CO2飽和濕度條件下，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于以下實驗。

1.2方法

1.2.1MTT法觀察C085對細(xì)胞增殖的影響取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107·L－1，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔180 μL，加入不同濃度的藥物，每個濃度均設(shè)3個復(fù)孔。加藥后置于37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一定時間后，每孔加入MTT (5 g·L－1) 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后2 000 r·min－1離心5 min，甩板扣干，各孔再加入150 μL的DMSO，震蕩溶解，在570 nm處測定OD值，計算細(xì)胞生長抑制率。實驗重復(fù)3次，取平均值。

細(xì)胞生長抑制率/%=(對照組OD570值－實驗組OD570值)/對照組OD570值×100%

以同一藥物的不同濃度對細(xì)胞生長抑制率作圖，可得到量效反應(yīng)曲線，根據(jù)線性回歸方程求出該藥物的半數(shù)抑制濃度IC50。

1.2.2Annexin V-FITC/PI雙熒光染色法檢測細(xì)胞凋亡調(diào)整細(xì)胞濃度為3×108·L－1，經(jīng)不同濃度藥物作用24 h后，離心收集(2 000 r·min－1，5 min)，用PBS洗滌細(xì)胞2次(2 000 r·min－1，5 min)，收集1×105～5×105細(xì)胞，加入500 μL的Bingding buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻，室溫避光反應(yīng)5～15 min，流式細(xì)胞儀分析藥物對K562細(xì)胞凋亡的影響。

1.2.3蛋白免疫印跡觀察細(xì)胞信號蛋白的表達(dá)藥物處理細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞，以0.01 mol·L－1預(yù)冷PBS(pH 7.2)洗2次，加入去污裂解緩沖液于4℃裂解30 min，離心，吸出上清，即為細(xì)胞總蛋白，用BCA法進行蛋白定量。各組均采用同樣的蛋白量上樣，在SDS聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳。電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉，加一抗4℃搖床孵育過夜，TBST洗去未結(jié)合的一抗。加二抗(1∶5 000稀釋)室溫?fù)u床孵育1 h。將ECL試劑盒中的A和B兩試劑等體積混合，滴加到Image Station 4000MM成像儀上。將PVDF膜正面朝下覆蓋在ECL試劑上，按成像儀的操作說明進行曝光。采用Photoshop軟件對圖像進行灰密度分析。

1.2.4JC-1熒光染色法檢測細(xì)胞線粒體膜電位變化取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整濃度為3×108·L－1，加入0、2.5、5、10 μmol·L－1的C085及IM作用24 h后，離心收集(2 000 r·min－1，5 min)，用PBS洗滌細(xì)胞2次(2 000 r·min－1，離心5 min)，收集1× 105～5×105細(xì)胞，加入JC-1熒光染料，37℃，5%飽和濕度CO2培養(yǎng)箱反應(yīng)15～20 min。室溫離心收集細(xì)胞，用1×Incubation buffer洗滌兩次。吸取500 μL 1×Incubation buffer重新懸浮細(xì)胞。轉(zhuǎn)移入流式管中，4℃避光，冰上保存，于60 min內(nèi)上機檢測。流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位△Ψm值，通過檢測紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)采用±s表示，實驗獨立重復(fù)3次。凡符合方差齊性的數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩組間比較采用Dunnett法。對不符合方差齊性的數(shù)據(jù)，則進行秩和檢驗(Kruskal Wallis法)，多組間兩兩比較采用Mann Whiteney U法。

2　結(jié)果

2.1C085對K562細(xì)胞增殖的抑制作用用不同濃度的C085 (1.25～20 μmol·L－1)作用于K562細(xì)胞24、48和72 h，IC50分別為2.82、2.46和2.3 μmol·L－1，而Cur作用K562細(xì)胞48h的IC50為15.28 μmol·L－1(Fig 1B)。C085呈濃度、時間依賴性地抑制K562細(xì)胞的增殖，48 h的IC50低于姜黃素的1/5。

Fig 1 In vitro K562 cells-killing activity of C085

2.2C085對K562細(xì)胞凋亡的影響為了明確C085對K562細(xì)胞的殺傷作用是否與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)，我們采用Annexin V-FITC/PI雙熒光染色法，流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡率。

實驗結(jié)果提示，C085在24 h即對K562細(xì)胞有較強的誘導(dǎo)凋亡作用，主要是中、晚期凋亡，10 μmol ·L－1時凋亡率可達(dá)65.9%。與陽性對照藥IM相比，誘導(dǎo)凋亡作用明顯(Fig 2，Tab 1)。

Tab 1 Effect of C085 on induction of apoptosis in K562 cells

2.3C085對K562細(xì)胞中p210BCR/ABL及其下游信號通路蛋白的影響B(tài)CR-ABL主要通過持續(xù)激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。BCR-ABL的下游促生長通路主要有PI3K-AKT-mTOR、Ras-Raf-MEK-ERK及Stat3、Stat5。我們已知C085可誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，為進一步研究其作用機制，我們采用抗磷酸化位點抗體測定p210BCR-ABL蛋白及其下游相關(guān)信號分子的磷酸化水平，從Fig 3可知，C085可濃度依賴性的下調(diào)BCR-ABL蛋白及其下游增殖相關(guān)通路信號分子的磷酸化水平，作用效果明顯強于IM。

2.4C085通過線粒體凋亡途徑促細(xì)胞凋亡線粒體跨膜電位的耗散被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件。在細(xì)胞凋亡過程中線粒體跨膜電位ΔΨm的耗散主要是由于線粒體內(nèi)膜的通透性孔道(PT孔道)開放，線粒體內(nèi)膜的通透性增加，細(xì)胞色素C等物質(zhì)釋放入胞質(zhì)，觸發(fā)細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)［10］。我們采用JC-1試劑盒配合流式細(xì)胞術(shù)檢測C085對CML細(xì)胞線粒體跨膜電位△Ψm的影響。

從Fig 4A看出C085可對K562細(xì)胞線粒體跨膜電位產(chǎn)生影響，線粒體膜電位紅綠比值降低，10 μmol·L－1時改變尤其明顯。而IM無此作用。說明C085能夠直接作用于線粒體的PT孔，引起線粒體膜電位△Ψm的改變，造成線粒體的損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

具有增強的PTK活性的BCR-ABL蛋白，可激活其下游與增殖、凋亡相關(guān)的蛋白信號分子。那么，C085在下調(diào)BCR-ABL蛋白及其下游信號分子磷酸化活性的同時，是否也會影響其下游與增殖、凋亡相關(guān)的蛋白信號分子?我們用蛋白免疫印跡法觀察Bax和Bcl-2的表達(dá)變化。Bcl-2的減少和Bax的增加，

進一步證明了C085通過線粒體凋亡途徑促進細(xì)胞凋亡(Fig 4B)。

Fig 2 Effect of C085 on induction of apoptosis in K562 cells

Fig 3 C085 inhibits tyrosine phosphorylation of Bcr-Abl and downstream targets

3　討論

姜黃素單體有明顯的體內(nèi)外抗癌活性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是其重要的作用方式，可阻斷細(xì)胞周期進程于G2－S期，屬于優(yōu)勢殺滅增殖期細(xì)胞的周期時相非特異抗癌藥［11－12］。Cur可誘導(dǎo)BCR-ABL表達(dá)陽性的CML細(xì)胞凋亡，尤其是Cur可在短時間內(nèi)明顯下調(diào)CML特異的BCR-ABL蛋白含量，并抑制BCR-ABL蛋白的PTK活性，提示對CML可能有特殊的治療意義［13］。為了進一步提高Cur的抗腫瘤活性，我們合成了一系列的衍生物，C085即是應(yīng)用拼合原理的姜黃素衍生物。

在初合成的抗腫瘤活性篩選中發(fā)現(xiàn)C085對多種腫瘤細(xì)胞具有較強的抑制作用，在此基礎(chǔ)上，我們對其抗CML細(xì)胞活性及機制做了初步研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C085對K562細(xì)胞有明顯的抑制作用，呈量效和時效關(guān)系，其抑制活性明顯優(yōu)于姜黃素，48 h 的IC50低于姜黃素的1/5。

BCR-ABL融合蛋白是CML惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵蛋白。與Abl蛋白酪氨酸激酶相比，其激酶活性大大增強，主要是自身磷酸化水平明顯提高。可激活多條與CML惡性表型有關(guān)系的細(xì)胞信號通路，如Ras/MAPK信號通路、PI3K/AKT信號通路、CRKL有關(guān)的信號通路、Src激酶通路及Jak-STAT通路等。這些信號通路的異常使骨髓細(xì)胞發(fā)生癌變、增殖異常、分化和凋亡受到抑制。C085在2.5 μmol·L－1時即可明顯抑制BCR-ABL的自磷酸化，BCR-ABL的自身磷酸化水平的下調(diào)隨之抑制了其下游信號分子Stat 5、Crkl的磷酸化，具有較強的抗CML作用，呈明顯的量效關(guān)系。同時，IM對BCR-ABL蛋白及其下游信號分子的磷酸化水平及蛋白含量的下調(diào)無作用或僅輕微的影響。

Fig 4 C085 triggers mitochondrial pathway of apoptosis in K562 cells

細(xì)胞凋亡是由體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡過程，主要有線粒體通路和死亡受體通路［14］。線粒體通路中細(xì)胞色素C (Cty-C)從線粒體向細(xì)胞質(zhì)釋放是很關(guān)鍵的一步。目前普遍認(rèn)為，Cyt-C是通過線粒體PT孔或Bcl-2家族成員形成的線粒體跨膜通道釋放到細(xì)胞質(zhì)中的。線粒體跨膜電位ΔΨm是維持線粒體正常功能所必需的，反映線粒體功能的完整性，是評價線粒體功能的敏感指標(biāo)。ΔΨm的耗散被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件，而PT孔道的開放會引起ΔΨm的下降。JC-1為陽離子脂質(zhì)熒光染料，有單體和多聚體兩種存在狀態(tài)，兩者的發(fā)射光譜不同。正常健康線粒體的膜電位具有極性，使JC-1被迅速攝入線粒體內(nèi)，并因濃度增高而在線粒體內(nèi)形成多聚體，流式細(xì)胞檢測時為紅色熒光(Q2象限) ;當(dāng)線粒體跨膜電位降低時，JC-l從線粒體內(nèi)釋放，紅光強度減弱，以單體的形式存在于胞質(zhì)內(nèi)，流式細(xì)胞檢測時為綠色熒光(Q4象限)，紅/綠比值能較好的反映線粒體膜電位的高低［15］。JC-1試劑盒配合流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，C085能夠直接作用于線粒體的PT孔使其開放，降低膜電位，造成線粒體損傷從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而IM無此作用。

CML的BCR-ABL癌蛋白主要通過影響B(tài)cl-2 ?家族蛋白抑制細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白主要位于線粒體內(nèi)外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜及細(xì)胞核外膜，其可形成離子通道或小孔，從而直接影響線粒體膜通透性以調(diào)節(jié)線粒體Cty-C、凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor，AIF)等的釋放，從而調(diào)節(jié)caspases的活化抑制或促進凋亡?？沟蛲龅鞍譈cl-2可通過抑制線粒體釋放Cty-C和直接與Apaf-1結(jié)合，抑制“Cty-CApaf-1-pro caspase-9”復(fù)合物的形成來抑制細(xì)胞凋亡，促凋亡蛋白Bax的作用正好相反。此外Bcl-2還可以反阻斷線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+，降低Ca2+超載及阻止與細(xì)胞凋亡相關(guān)Ca2+依賴性核酸內(nèi)切酶的活化而阻止caspase-9的激活;將caspases運輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)的膜結(jié)構(gòu)(如線粒體膜)，阻止caspases活化［16］; Bcl-2還是一種抗氧化劑，可抑制氧自由基的產(chǎn)生，減少細(xì)胞凋亡發(fā)生。我們的研究結(jié)果(Fig 3B)可看出C085可以引起B(yǎng)cl-2的減少和Bax的增加，這進一步證明了C085可通過線粒體凋亡途徑促細(xì)胞凋亡，而IM組相關(guān)蛋白的變化均沒有C085組明顯，說明其促凋亡作用弱于C085，這與之前MTT及流式檢測細(xì)胞凋亡率的結(jié)果相符。

綜上所述，C085可抑制BCR-ABL+CML細(xì)胞的生長與其抑制BCR-ABL蛋白激酶活性，下調(diào)相關(guān)信號通路有關(guān)。BCR-ABL基因是重要的抑制凋亡基因之一，而其編碼的融合蛋白質(zhì)是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的根本原因，C085能以此為作用靶點，抑制其表達(dá)，將有望從發(fā)病本質(zhì)上殺傷CML細(xì)胞。

(本課題完成于福建省天然藥物藥理學(xué)重點實驗室，在此對實驗室的各位老師、同學(xué)的幫助表示由衷的感謝! )

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◇復(fù)方藥物藥理學(xué)◇

Effects of curcumin derivatives C085 on K562 cells and its mechanism

WU Ying1，2，CHEN Rui-jia1，WU Li-xian1，XU Jian-hua1
(1.Fujian Key Laboratory of Natural Medicine Pharmacology，2.Dept of Natural Medicines，School of Pharmacy，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350108，China)

Abstract:AimTo explore the anti-proliferation and apoptotic effects of C085，a curcumin derivative，on K562 cells and its mechanism.Methods MTT assay and flow cytometry were used to examine cell proliferation and apoptosis，respectively.The phosphorylation levels of Bcr-Abl initiated signaling proteins were analyzed using Western blot.Results The results showed that C085 suppressed the growth of K562 cells and the IC(50)value was about 5-fold lower than that of Cur.C085 also induced significant apoptosis on K562 cells in 24 hours when compared with imatinib.Western blot results demonstrated that C085 down-regulated the phosphorylation of Bcr-Abl in K562 cells in a dose-dependent manner.The phosphorylation of Stat 5 and Crkl，which were downstream signaling proteins of Bcr-Abl kinase，was also inhibited by C085.C085 caused the opening of mitochondrial PT holes as detected by JC-1 fluorescent，which inhibited Bcl-2 and enhanced Bax，then induced apoptosis.ConclusionC085 inhibited BCR-ABL+K562 cells through inhibiting BCRABL kinase activity and down-regulating its downstream signal proteins.Directly acting on mitochondrial PT hole and then activating apoptosis-associated proteins are also involved in the pro-apoptotic effect of C085.

Key words:C085; curcumin derivative; IM; BCRABL; proliferation; apoptosis; mechanism

作者簡介:吳鶯(1979－)，女，碩士，講師，研究方向:藥理學(xué)，Tel: 0591-22862016，E-mail: wuying97414@ tom.com;許建華(1958－)，男，博士，教授，研究方向:藥理學(xué)，E-mail: xjh@ mail.fjmu.edu.cn

基金項目:福建省教育廳中青年教師資助項目(No JA13150)

收稿日期:2015－02－19，修回日期:2015－03－26

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1001－1978(2015) 06－0870－06中國圖書分類號: R282.71; R284.1; R329.24; R329.25

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.026