羅格列酮通過IRS-1/Akt信號通路改善ob/ob小鼠的認(rèn)知功能障礙

柴水琴，李繼斌，王宏英，宋　曄，劉　丹，肖曉秋，

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院脂糖代謝實(shí)驗(yàn)室，重慶　400016;2.重慶醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院營養(yǎng)與衛(wèi)生學(xué)教研室，重慶　400016;3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒童發(fā)育疾病研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶　400014)

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羅格列酮通過IRS-1/Akt信號通路改善ob/ob小鼠的認(rèn)知功能障礙

柴水琴1，李繼斌2，王宏英3，宋曄3，劉丹3，肖曉秋1，3

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院脂糖代謝實(shí)驗(yàn)室，重慶400016;2.重慶醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院營養(yǎng)與衛(wèi)生學(xué)教研室，重慶400016;3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒童發(fā)育疾病研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400014)

摘要:目的本研究旨在對ob/ob小鼠腹腔注射羅格列酮，觀測小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力及大腦海馬組織中與認(rèn)知功能相關(guān)的蛋白表達(dá)變化，進(jìn)而探討引起這些變化的機(jī)制。方法C57BL/6J♂ob/ob小鼠分兩組，一組腹腔注射羅格列酮(RSG)，即羅格列酮組(ob/ob-RSG)，一組注射同等體積的生理鹽水，即生理鹽水組(ob/ob-Saline)，同鼠齡正常C57BL/6J(WT)♂小鼠為同型對照，即正常組(WT)。飼養(yǎng)7個(gè)月后注射藥物并連續(xù)檢測隨機(jī)血糖10 d，新事物探索實(shí)驗(yàn)檢測空間學(xué)習(xí)記憶能力。Western blot方法檢測海馬中BACE1、磷酸化Tau、磷酸化IRS1及IRS1、磷酸化Akt及Akt等蛋白的表達(dá)水平，ELISA的方法檢測Aβ(1－40)的水平。結(jié)果羅格列酮組小鼠隨機(jī)血糖水平明顯低于生理鹽水組，并趨于正常組。新事物探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示羅格列酮組的空間學(xué)習(xí)記憶能力相對于生理鹽水組有所改善。羅格列酮組小鼠海馬組織中BACE1及磷酸化Tau的表達(dá)水平相對于生理鹽水組明顯下降，并趨于正常組。類似的，海馬組織中Aβ水平在羅格列酮處理后明顯下降。羅格列酮組小鼠大腦海馬組織中胰島素信號通路相關(guān)蛋白IRS1以及下游Akt的磷酸化水平相對于生理鹽水組均明顯增高，并趨于正常組。結(jié)論ob/ob小鼠在注射羅格列酮后，海馬組織中IRS1/Akt胰島素信號通路被激活進(jìn)而改善肥胖導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙。

關(guān)鍵詞:羅格列酮; ob/ob小鼠;胰島素抵抗; IRS1/Akt; BACE1;認(rèn)知障礙

大量研究已證實(shí)，糖尿病和AD的發(fā)病機(jī)制有著密切的關(guān)系［1］，糖代謝紊亂可能是誘發(fā)AD的始動(dòng)因子，甚至有學(xué)者稱AD就是3型糖尿?。?］。糖尿病導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的機(jī)制目前尚未完全闡明。近來有研究發(fā)現(xiàn)，胰島素代謝紊亂不僅發(fā)生在糖尿病患者的外周組織器官，而且在AD患者大腦中也出現(xiàn)高胰島素，胰島素分泌減少和胰島素抵抗都會(huì)加大患AD的風(fēng)險(xiǎn)［3］。有研究認(rèn)為胰島素在大腦中不是糖代謝的主要調(diào)控因子，但可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖［4］，以及調(diào)節(jié)大腦皮質(zhì)和海馬組織中的突出可塑性［5］，從而影響學(xué)習(xí)記憶能力。海馬是學(xué)習(xí)記憶的重要神經(jīng)中樞，與認(rèn)知功能關(guān)系密切。有研究已經(jīng)表明，在1型糖尿病大鼠模型中，大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯受損，海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡逐漸增多，并與認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)［6］。

羅格列酮(rosiglitazone，RSG)是一種PPARγ受體激動(dòng)劑，通過改善外周組織胰島素受體敏感性而廣泛應(yīng)用于2型糖尿病的治療。然而有研究發(fā)現(xiàn)，羅格列酮可以通過激活ERK等信號通路來改善AD動(dòng)物模型的認(rèn)知功能［7－9］。那么，本研究旨在觀察PPARγ受體激動(dòng)劑羅格列酮能否改善因代謝紊亂而導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙以及對羅格列酮改善這一現(xiàn)象的機(jī)制進(jìn)行探討。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物模型的建立及分組選取♂ob/ob小鼠36只，正常C57BL/6J(Wild type，WT)♂小鼠18只。ob/ob小鼠隨機(jī)分為兩組，每組18只，一組腹腔注射10 mg·kg－1·d－1羅格列酮，即羅格列酮組(ob/ob-RSG)，另一組以及WT小鼠分別注射同等體積的生理鹽水，即生理鹽水組(ob/ob-Saline)和正常對照組(WT)。小鼠均于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院SPF級動(dòng)物房飼養(yǎng)，遵循國際標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件，12 h正常光照，室溫(22±1)℃，常年濕度60% RH，壓差40 kPa，定期消毒并更換籠子，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。連續(xù)每周檢測3組小鼠的體重，至7個(gè)月后注射藥物并連續(xù)檢測隨機(jī)血糖10 d。腹腔注射10%的水合氯醛處死后分離小鼠大腦海馬組織。

1.2新事物探索實(shí)驗(yàn)(novel object recognition)裝置為內(nèi)外黑色開口方形木盒，正上方置攝像頭，測試分3 d: d 1，將小鼠放于空置的盒子內(nèi)自由活動(dòng)適應(yīng)環(huán)境5 min，之后放回飼養(yǎng)籠; d 2，即24 h后，將盒子固定的4個(gè)角落分別放置不同的物體A、B、C、D，小鼠放入盒子的正中央，進(jìn)行5 min的自由探索后放回飼養(yǎng)籠; d 3，即為測試階段，交換其中任意兩個(gè)物體即C、D的位置，再次將小鼠從正中央放入，自由探索5 min，放回飼養(yǎng)籠。每只小鼠測試完成后，用酒精擦拭干凈后放入下一只。測試期間，小鼠的鼻子在1cm內(nèi)探向物體或者接觸到物體則為有效探索，分別記錄測試階段小鼠探索A、B物體和C、D物體的時(shí)間，以小鼠探索C、D物體的時(shí)間與A、B物體的時(shí)間的比值來反映小鼠對新事物的探索能力。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-PCR)采用TRIzol法提取大腦海馬組織總RNA，RNA逆轉(zhuǎn)錄采用ABI公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的方法，在Bio-Rad熒光定量PCR儀上檢測目的基因mRNA表達(dá)水平，以β-actin作為內(nèi)參。引物通過primer5.0軟件設(shè)計(jì)，APP PCR引物正義鏈: 5'-CGGAATTCCCTTGGTGTTCTTTGCA GAAG-3'，反義鏈: 5'-CGGAATTCCGTTCTGCATCTG CTCAAAG-3'。內(nèi)參β-actin引物正義鏈: 5'-TGCTG TCCCTGTATGCCTCTG-3'，反義鏈: 5'-GTTCATGC GCTCGTAGATCA-3'。

1.4蛋白免疫印跡法(Western blot)采用羅氏(Roche)蛋白裂解液提取海馬組織總蛋白，碧云天BCA試劑盒檢測蛋白濃度，SDS-PAGE方法分離目的蛋白，其中分離膠濃度10%，濃縮膠為5%，PVDF轉(zhuǎn)膜。BACE1為兔抗鼠單克隆一抗(Cell signaling Technology)，p-Akt及Total-Akt為兔抗鼠多克隆一抗(Cell Signaling Technology)，p-IRS1及Total-IRS1也為兔抗鼠多克隆一抗(Abcam公司)，均為山羊抗兔二抗(Abcam公司)。ECL試劑盒(Bio-Rad公司)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。所得數(shù)據(jù)用Quantity One軟件進(jìn)行定量分析，以目的基因與β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對表達(dá)量。

1.5酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)稱量完整大鼠海馬組織，按照5 mL·g－1海馬質(zhì)量加入相當(dāng)體積0.01 mol·L－1預(yù)冷的PBS，在冰上用玻璃勻漿器勻漿;4℃，5 000×g·min－1離心5 min，取上清。BCA試劑盒(Thermo公司)檢測總蛋白濃度。嚴(yán)格按照淀粉樣蛋白Aβ1－40檢測試劑盒(武漢尤爾生)說明書步驟進(jìn)行。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度值(optical density，OD值)，計(jì)算樣品濃度。以樣本Aβ1－40濃度與總蛋白濃度的比值表示Aβ1－40的表達(dá)水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以±s表示，兩組之間同一時(shí)相點(diǎn)采用t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1ob/ob小鼠在RSG處理后隨機(jī)血糖降低與生理鹽水組相比較，RSG處理后ob/ob小鼠的血糖水平從(22.78±1.62) mmol·L－1降低至(6.43± 1.17) mmol·L－1，表明ob/ob小鼠在RSG處理后糖代謝得到明顯的改善，結(jié)果見Fig 2; ob/ob小鼠體重明顯高于正常組，但是短時(shí)間RSG處理并沒有改變ob/ob小鼠的體重，見Fig 1。

Fig 1 Body weight of three groups

Fig 2 Random blood glucose of three groups

2.2羅格列酮改善了ob/ob小鼠的認(rèn)知功能通過新事物探索實(shí)驗(yàn)對小鼠的空間記憶及探索能力進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)代謝受損的ob/ob小鼠對C、D兩個(gè)新事物的探索時(shí)間明顯低于正常小鼠對新事物的探索時(shí)間，ob/ob小鼠的空間記憶能力明顯下降，而RSG處理后ob/ob小鼠的這一現(xiàn)象得到改善，見Tab 1。

2.3羅格列酮處理后ob/ob小鼠海馬組織中APP、BACE1及Aβ的表達(dá)水平降低為觀察肥胖對認(rèn)知功能的影響以及羅格列酮對肥胖ob/ob小鼠認(rèn)知功能的改善作用，分別采用RT-PCR及Western blot的方法檢測大腦海馬組織中APP和BACE1表達(dá)水平變化。結(jié)果顯示，與正常組相比較ob/ob小鼠海馬組織中APP表達(dá)水平增高(P＜0.01)，然而在羅格列酮處理后ob/ob小鼠海馬組織中APP表達(dá)水平降低(P＜0.05)，并且趨近于正常組，見Fig 3;同時(shí)ob/ob小鼠BACE1的蛋白表達(dá)水平也升高(P＜0.05)，羅格列酮處理后得到逆轉(zhuǎn)，見Fig 5、6;另外，ob/ob小鼠大腦海馬組織中神經(jīng)纖維纏結(jié)組份tau蛋白的磷酸化水平異常增加，羅格列酮處理后這一現(xiàn)象得到改善。采用ELISA方法對BACE1剪切APP后的終產(chǎn)物β淀粉樣蛋白(Aβ)水平測定結(jié)果顯示ob/ob小鼠海馬組織中Aβ水平明顯增高(P＜0.05)，羅格列酮處理后ob/ob小鼠海馬組織中Aβ水平降低(P＜0.05)，見Fig 4。

Tab 1 Relative time of novel object recognition among three groups

Fig 3 Expression levels of APP in hippocampus of three groups

2.4ob/ob小鼠在羅格列酮處理后海馬組織中IRS1及Akt磷酸化增強(qiáng)對3組小鼠大腦海馬組織胰島素信號通路中IRS1及Akt磷酸化水平檢測，結(jié)果顯示與正常組相比較，生理鹽水處理組IRS1與Akt磷酸化水平減少(P＜0.05，P＜0.01)，羅格列酮處理后這一現(xiàn)象得到改善(P＜0.05，P＜0.01)，但3組動(dòng)物海馬組織中總IRS1以及Akt表達(dá)水平差異無顯著性，見Fig 7、8。

Fig 4 Expression levels of Aβ in hippocampus of three groups by ELISA

Fig 5 BACE1 and p-Tau protein levels in hippocampus of three groups by Western blot

Fig 6 BACE1 quantitative expressionin hippocampus of three groups

3　討論

近年來，糖尿病與AD的關(guān)系越來越受到關(guān)注，糖尿病患者到老年期患AD的風(fēng)險(xiǎn)是正常人的2～3倍［10］，而AD患者中有80%都出現(xiàn)糖代謝異常［11］。但是糖尿病導(dǎo)致AD的分子機(jī)制目前尚未完全闡明。有研究發(fā)現(xiàn)胰島素通過PI3K-Akt信號通路可以預(yù)防神經(jīng)細(xì)胞的凋亡［12］，臨床研究顯示糖尿病患者與正常人相比大腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡更加嚴(yán)重［13］，這種現(xiàn)象可能是由于胰島素信號通路對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用丟失而導(dǎo)致，可見胰島素信號通路在糖尿病和AD中發(fā)揮著重要的作用。在本研究中，新事物探索實(shí)驗(yàn)表明代謝紊亂的ob/ob小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的認(rèn)知功能障礙。導(dǎo)致AD發(fā)生的最主要病理機(jī)制就是Aβ沉積，那么我們的研究結(jié)果顯示ob/ob小鼠大腦海馬組織中Aβ水平升高，且導(dǎo)致其生成的關(guān)鍵酶BACE1表達(dá)增強(qiáng)，BACE1的底物APP表達(dá)量也增加，tau蛋白異常磷酸化增強(qiáng)。腦內(nèi)大量的Aβ產(chǎn)生并聚積形成老年斑，導(dǎo)致大腦神經(jīng)纖維纏繞，軸突受損及突觸丟失，從而認(rèn)知功能下降。本研究表明代謝紊亂導(dǎo)致Aβ、APP及BACE1表達(dá)增強(qiáng)，可能參與了AD發(fā)生。

Fig 7 p-Akt and total Akt protein levels in hippocampus of three groups by Western blot

Fig 8 p-IRS1 and total IRS1 protein levels in hippocampus of three groups by Western blot

Akt是P-IRS1/PI3K信號通路下游的一種絲氨酸/蘇氨酸激酶。當(dāng)胰島素作用于胰島素受體后，胰島素受體底物1和2(IRS1/2)發(fā)生磷酸化，進(jìn)而激活下游的多種蛋白［14］，其中脂質(zhì)激酶磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)在胰島素代謝方面發(fā)揮重要的作用，PI3K被激活后可以使細(xì)胞膜上的磷脂酰肌醇4，5二磷酸(PIP2)轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇3，4，5三磷酸(PIP3)，PIP3使下游Akt發(fā)生磷酸化［15］。Akt一方面可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化及凋亡過程，另一方面可使糖原合成酶激酶3β(GSK3β)磷酸化。非磷酸化的GSK3β對神經(jīng)細(xì)胞具有毒性作用，使突觸可塑性減弱，當(dāng)GSK3β磷酸化以后可降低這一毒性反應(yīng)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)ob/ob小鼠海馬組織中總IRS1 及Akt表達(dá)量雖未發(fā)生變化，但I(xiàn)RS1與Akt磷酸化水平卻明顯降低，說明ob/ob小鼠大腦海馬組織中胰島素信號通路受損;且p-IRS1/p-Akt水平降低的同時(shí)，BACE1表達(dá)增強(qiáng)，表明胰島素信號通路受損可能參與調(diào)節(jié)了Aβ生成這一病理學(xué)過程。當(dāng)大量的Aβ產(chǎn)生并聚集后形成淀粉樣沉淀從而將導(dǎo)致AD發(fā)生。

PPARγ受體激動(dòng)劑羅格列酮可以增強(qiáng)外周組織對胰島素的敏感性，因此成為治療糖尿病患者胰島素抵抗的有效藥物之一。然而在對AD模型的研究中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)羅格列酮可逆轉(zhuǎn)海馬組織齒狀回區(qū)ERK MAPK信號通路，并且可以改善AD小鼠的突出可塑性，增強(qiáng)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放與傳導(dǎo)，進(jìn)而改善AD小鼠的認(rèn)知功能［8－9］。本研究結(jié)合了糖尿病作為AD的一個(gè)誘因，胰島素信號通路作為兩者共同的病理機(jī)制，從而利用羅格列酮增強(qiáng)胰島素敏感性這一作用機(jī)制，對糖尿病樣ob/ob小鼠進(jìn)行藥物干預(yù)，發(fā)現(xiàn)羅格列酮不僅可以改善ob/ob小鼠的糖代謝異常而且改善了因代謝異常導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙，這一研究為糖尿病導(dǎo)致AD的預(yù)防及治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

(本課題在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院認(rèn)知與學(xué)習(xí)記憶障礙轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。感謝重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院為我的課題研究提供技術(shù)支持和儀器設(shè)備。感謝致力于認(rèn)知與學(xué)習(xí)記憶障礙轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)方向的宋偉宏院士，在阿爾茨海默癥病理性機(jī)制方面給予了專業(yè)的指導(dǎo))。

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Rosiglitazone attenuates cognitive function via altering hippocampal IRS-1/Akt signaling pathways in ob/ob mouse

CHAI Shui-qin1，LI Ji-bin2，WANG Hong-ying3，SONG Ye3，LIU Dan3，XIAO Xiao-qiu1，3
(1.Laboratory of Lipid＆Glucose Metabolism，the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University; 2.Dept of Nutrition and Food Hygiene，School of Public Health and Management，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China; 3.Ministry of Education Key Laboratory of Child Development and Disorders，Children's Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400014，China)

Abstract:AimTo identify alteration in key molecular components related to memory formation and insulin signaling in the hippocampus after rosiglitazone was injected into the ob/ob mice to test whether cognitive dysfunction was pharmacologically reversed by regulation of rosiglitazone.Methods The age-matched mice were divided into three groups (n=18) : Saline-treated WT mice (WT-Saline) ; Saline-treated ob/ob mice (ob/ob-Saline) and RSG-treated ob/ob mice (ob/ob-RSG) through intraperitoneal injection of rosiglitazone (RSG).The random glucose levels were measured for 10 days during the intraperitoneal injection period.Novel object recognition was performed before mice were sacrificed.Western blot was implemented to evaluate the following proteins: BACE1，p-Tau，p-IRS1， IRS1，p-Akt and Akt in hippocampal tissues.The Aβ(1-40)levels were detected by ELISA Kit.Results The random blood glucose levels were significantly reduced in ob/ob-RSG compared with ob/ob-saline.RSG treatment led to an increase in hippocampus-dependent cognition of ob/ob mice according to the novel object recognition.The proteins levels of BACE1，p-Tau and Aβ were lowered in RSG-treated ob/ob mice.Furthermore，RSG treatment up-regulated hippocampal p-IRS1/IRS1 and p-Akt/Akt ratio.Conclusion Rosiglitazone ameliorates cognitive deficits in ob/ob mice through up-regulating insulin signaling pathways in the hippocampus.

Key words:rosiglitazone; ob/ob mice; insulin resistance; IRS1/Akt; BACE1; cognitive dysfunction

作者簡介:柴水琴(1989－)，女，碩士，研究方向:代謝性疾病與認(rèn)知障礙，E-mail: 395950727@ qq.com;肖曉秋(1964－)，男，博士，教授，研究方向:內(nèi)分泌與代謝，通訊作者，E-mail: xiaoxq@ cqmu.edu.cn

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金面上資助項(xiàng)目(No 81270947) ;教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目(No 20115503110008)

收稿日期:2015－02－06，修回日期:2015－03－16

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1001－1978(2015) 06－0785－05中國圖書分類號: R-332; R322.81; R338.64; R458.5; R741; R977.15

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.010