肢體后適應(yīng)對(duì)高糖狀態(tài)下大鼠腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用

陳剛領(lǐng)，徐嵐溪，趙　歡，吳曉瑩，柴玲玲，曾冬琳，吳　琪

(中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院1.中藥藥理教研室、2.生藥學(xué)研究室，江蘇南京　211198)

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肢體后適應(yīng)對(duì)高糖狀態(tài)下大鼠腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用

陳剛領(lǐng)1，徐嵐溪1，趙歡1，吳曉瑩1，柴玲玲1，曾冬琳1，吳琪2

(中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院1.中藥藥理教研室、2.生藥學(xué)研究室，江蘇南京211198)

摘要:目的探討肢體后適應(yīng)(limb remote ischemic postconditioning，LRIP)對(duì)急性高糖狀態(tài)下大鼠腦缺血/再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)的保護(hù)作用，并初步闡明其機(jī)制。方法大鼠腹腔注射50%葡萄糖(6 mL·kg(－1))造成急性高血糖模型，采用線栓法復(fù)制大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，將大腦中動(dòng)脈栓塞1.5 h后再灌注，且同時(shí)刻給LRIP組大鼠LRIP操作，將大鼠左后肢股動(dòng)脈夾閉5 min/再通5 min(此為1個(gè)循環(huán))，連續(xù)3個(gè)循環(huán)。再灌注2 h后，檢測(cè)各組大鼠行為學(xué)指標(biāo)，摘眼球取血，測(cè)定血清中一氧化氮(nitric oxide，NO)濃度及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力;取全腦切片后氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyhetrazolium chloride，TTC)染色檢測(cè)腦梗死面積。結(jié)果LRIP能改善急性高血糖狀態(tài)下腦IRI大鼠的行為學(xué)評(píng)分，升高血清中NO濃度及SOD活力，能減小腦梗死面積，以上指標(biāo)LRIP組與IRI模型組比較差異均具有顯著性(P＜0.05)。結(jié)論LRIP對(duì)急性高血糖狀態(tài)大鼠的腦IRI有保護(hù)作用，該作用部分通過(guò)升高血清SOD活力及NO水平實(shí)現(xiàn)。關(guān)鍵詞:肢體后適應(yīng);急性高血糖;缺血/再灌注;超氧化物歧化酶;一氧化氮;大鼠

在所有腦卒中病例中，缺血性腦卒中占87%。盡管多年來(lái)人們不斷努力尋求腦卒中的防治方法，但其發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)仍未能根本改變［1－4］。對(duì)急性缺血性腦卒中的治療，特別強(qiáng)調(diào)超早期(發(fā)病1～6 h內(nèi))、急性期(發(fā)病48 h內(nèi))的溶栓，降纖(降解纖維蛋白原)，腦血管搭橋及介入療法治療［5］。但是，血流再通后造成的腦缺血/再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)又給缺血性腦卒中的治療帶來(lái)新的問(wèn)題。

高血糖是影響發(fā)病的重要因素，研究表明，高血糖患者患缺血性腦卒中的危險(xiǎn)程度是血糖正常者的2.40倍，且患病危險(xiǎn)性男性高于女性［6］。此外，在高血糖狀態(tài)下，腦梗死區(qū)域血流再通后造成的IRI會(huì)更嚴(yán)重［7－9］。

肢體后適應(yīng)(limb remote ischemic postconditioning，LRIP)是在機(jī)體重要器官(如心、腦)缺血后的再灌注時(shí)段，對(duì)遠(yuǎn)端肢體做短時(shí)間的缺血/再通血的操作，以減輕重要器官IRI的一種療法。大量研究表明，LRIP能有效減輕腦IRI［10－14］。但LRIP能否減輕高血糖狀態(tài)下的腦IRI尚未知，我們的本項(xiàng)研究運(yùn)用大鼠急性高血糖模型，驗(yàn)證LRIP對(duì)高血糖狀態(tài)下腦IRI的作用，并初步探討其機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料①藥品與試劑:葡萄糖測(cè)定試劑盒、SOD測(cè)定試劑盒、一氧化氮(NO)測(cè)定試劑盒，均由南京建成生物工程研究所提供;氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyhetrazolium chloride，TTC)，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;50%葡萄糖注射液，購(gòu)自湖南科倫制藥有限公司。②動(dòng)物: SD大鼠，♂，體質(zhì)量(260 ±20) g，清潔級(jí)，購(gòu)于江蘇大學(xué)，許可證號(hào): SCXK(蘇) 2013－0011。③主要儀器設(shè)備:酶標(biāo)儀(熒光酶標(biāo)儀Varioskan Flash，Thermo Electron Corporation)。

1.2方法

1.2.1分組將30只SD大鼠隨機(jī)分為3組(n=10) :高血糖假手術(shù)組(Sham組)、高血糖+缺血/再灌注損傷模型組(IRI組)、高血糖+缺血/再灌注損傷+肢體后適應(yīng)組(LRIP組)。所有大鼠腹腔注射50%葡萄糖(6 mL·kg－1)，造成急性高血糖［15－16］。將各組大鼠于注射葡萄糖30 min后麻醉，除Sham組外，分離其他兩組大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈，從頸外動(dòng)脈向頸內(nèi)動(dòng)脈插栓線，栓塞大腦遠(yuǎn)端中動(dòng)脈(MCAO)。對(duì)于Sham組大鼠，僅分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈而不插線。待大腦遠(yuǎn)端中動(dòng)脈栓塞1.5 h后，拔出栓線至頸外、頸內(nèi)動(dòng)脈的分叉處，使再灌注。其中，LRIP組于再灌注的同時(shí)立刻做LRIP操作，即夾閉大鼠左后肢股動(dòng)脈5 min/再通5 min(此為1個(gè)循環(huán))，連續(xù)3個(gè)循環(huán)。各組大鼠于再灌注2 h后(Sham組大鼠同時(shí)刻處理)作行為學(xué)測(cè)定。

1.2.2本位反射測(cè)定將大鼠放置于桌面上，操作者一手提大鼠尾巴，另一只手輕推大鼠的肩部，將其橫向移動(dòng)20 cm，之后向相反的方向重復(fù)該測(cè)試。正常大鼠反應(yīng)為左上肢支撐或抓桌面，IRI組大鼠表現(xiàn)為左上肢力度減弱或無(wú)反應(yīng)。評(píng)分0～2分，得分越多，功能損害越嚴(yán)重。0分，大鼠抵抗力較大，并且在推動(dòng)過(guò)程中不斷用上肢支撐或抓桌面; 1分，左上肢對(duì)抗力度減小; 2分，左上肢無(wú)對(duì)抗，既不支撐也不抓桌面［17］。

1.2.3前肢放置測(cè)定該測(cè)定用大鼠觸須誘導(dǎo)的前肢放置情況來(lái)評(píng)價(jià)。操作者手持大鼠軀體，使大鼠的前肢能自由運(yùn)動(dòng)，輕輕的上下晃動(dòng)大鼠，使大鼠肌肉充分放松。操作者將大鼠放置在桌邊，使大鼠的胡須觸到桌面的邊緣，正常的大鼠會(huì)將兩側(cè)的前肢迅速放到桌面上。單側(cè)大腦損傷的大鼠，損傷大腦同側(cè)的前肢仍保持較好的反應(yīng)能力。每只大鼠測(cè)定10次，記錄前肢放置失敗的次數(shù)［18］。

1.2.4尾部懸空測(cè)定操作者提大鼠尾部，使大鼠頭部距桌面5～10 cm，一側(cè)大腦損傷的大鼠會(huì)將身體迅速轉(zhuǎn)向另一側(cè)。記錄大鼠扭轉(zhuǎn)身體角度超過(guò)90°的次數(shù)，重復(fù)20次，記錄有效抬頭的百分率［17］。

1.2.5血清中NO濃度測(cè)定將測(cè)定過(guò)本位反射后的各組大鼠摘眼球取血，離心分離血清，用試劑盒測(cè)定血清中NO濃度。

1.2.6血清中SOD活力測(cè)定將測(cè)定過(guò)本位反射后的各組大鼠摘眼球取血，離心分離血清，用試劑盒測(cè)定血清中SOD活力。

1.2.7腦梗死面積測(cè)定將各組大鼠取全腦，－20℃冷凍15 min后連續(xù)切出5片冠狀切片，每片厚度約為2 mm，置于1% TTC溶液中，37℃避光孵育20 min，每5 min翻動(dòng)一次，之后用PBS溶液清洗3次，4%甲醛溶液固定24 h后拍照，用圖像分析軟件計(jì)算梗死面積。腦梗死面積/%=(非缺血半球的面積－缺血半球未梗死部分的面積)/非缺血半球的面積×100%。以梗死面積百分比反映缺血后腦損傷的嚴(yán)重程度，統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行組間比較［14，19］。

2　結(jié)果

2.1血糖值測(cè)定高血糖組大鼠在手術(shù)前30 min腹腔注射50%葡萄糖6 mL·kg－1，造成急性高血糖。在注射葡萄糖前(0 h)，以及注射葡萄糖后0.5、1.5、3、4 h尾尖取血，離心分離血清。測(cè)定血糖值，結(jié)果表明，急性高血糖模型造模成功(Fig 1)。

Fig 1　Blood glucose values ofacute hyperglycemia rat (±s，n=6～8)

2.2行為學(xué)評(píng)分測(cè)定

2.2.1本位反射測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Sham組大鼠相比，Control組(IRI組)大鼠前肢抵抗能力減弱，前肢支撐及抓桌面力度均降低甚至消失。LRIP對(duì)急性高血糖狀態(tài)下腦IRI大鼠本位反射無(wú)改善作用(Fig 2)。

2.2.2前肢放置測(cè)定與Sham組相比，Control組大鼠胡須觸碰到桌面后，左前肢抓桌面的次數(shù)明顯減少。LRIP操作對(duì)腦IRI大鼠的前肢放置無(wú)改善作用(Fig 3)。

Fig 2　Postural reflex test (±s，n=6～8)

Fig 3 Vibrissa test±s，n=6～8)

2.2.3尾部懸空測(cè)定Control組與Sham組相比，大鼠向左側(cè)彎曲身體的次數(shù)明顯增多(P＜0.01)。LRIP操作能明顯減少腦IRI大鼠左側(cè)彎曲身體的次數(shù)(P＜0.05，見(jiàn)Fig 4)。

2.3腦梗死面積測(cè)定與Sham組相比，Control組大鼠的腦梗死面積增大，差異具有顯著性(P＜0.01)。LRIP能減小腦IRI大鼠的腦梗死面積(見(jiàn)Fig 5)。

2.4血清中的SOD活力LRIP能升高腦IRI模型大鼠血清中的SOD活力，與Control組相比差異具有顯著性(P＜0.05)。見(jiàn)Fig 6。

Fig 4　Tail hang test (珋±s，n=6～8)

Fig 5 Representative infarcts stained by TTCfrom each group (±s)

2.5血清中的NO濃度Control組大鼠血清中NO濃度增高，與Sham組相比差異具有顯著性(P＜0.01)。經(jīng)過(guò)LRIP操作后，大鼠血清中NO濃度升高，與Control組相比差異具有顯著性(P＜0.01)。見(jiàn)Fig 7。

Fig 6 SOD activity in rat serum (±s，n=6～8)

Fig 7 NO concentration in rat serum(±s，n=6～8)

3　討論

高血糖是影響缺血性腦卒中發(fā)病的重要因素，在高血糖狀態(tài)下，機(jī)體患缺血性腦卒中危險(xiǎn)程度增加，且后繼的IRI亦會(huì)加重［7］。高血糖加重腦IRI可能與興奮性氨基酸中毒、自由基生成、鈣超載、血腦屏障破壞、炎性因子的損害以及細(xì)胞凋亡等因素相關(guān)［20－22］。

我們之前的研究表明，LRIP能有效減輕腦IRI［14］，但LRIP是否能減輕高糖狀態(tài)下的腦IRI尚屬未知。本研究結(jié)果表明，LRIP能改善急性高血糖狀態(tài)下腦IRI大鼠的尾部懸空測(cè)定評(píng)分，減小模型大鼠的腦梗死面積，升高IRI模型大鼠血清中的NO濃度及SOD活力。

在高血糖狀態(tài)下，LRIP升高血清中SOD活力可增加自由基清除，減少后者造成的損傷［23－24］。NO濃度升高可以擴(kuò)張血管，改善IRI造成的“無(wú)復(fù)流現(xiàn)象”［25－26］。但過(guò)高濃度的NO也可能會(huì)導(dǎo)致滲出增多，水腫加重，具體有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上，本研究結(jié)果表明，LRIP能減輕高血糖狀態(tài)下大鼠的腦IRI損傷，該作用部分通過(guò)升高血清SOD活力，增加自由基清除，以及提升血清中NO濃度以增加側(cè)枝循環(huán)實(shí)現(xiàn)。我們進(jìn)一步的研究將關(guān)注LRIP減輕高血糖狀態(tài)下腦IRI的具體機(jī)制。

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Protective effects of limb remote ischemic postconditionting on ischemic stroke rats under hyperglycemia

CHEN Gang-ling1，XU Lan-xi1，ZHAO Huan1，WU Xiao-ying1，CHAI Ling-ling1，ZENG Dong-lin1，WU Qi2
(1.Dept of Pharmacology of Chinese Materia Medica，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China; 2.Dept of Pharmacognosy Research，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China)

Abstract:AimTo study the protective effects of limb remote ischemic postconditioning (LRIP) on ischemic stroke rats under hyperglycemia and explore the mechanisms.Methods Rats were given 50% glucose (6 mL·kg(－1)) by intraperitoneal injection to get acute hyperglycemia model.Then middle cerebral artery occlusion (MCAO) models were created.After blocking middle artery for 1.5 h and reperfusion for 2 h，behavioral testing，infarct size of brain，NO concentration and SOD activity in the serum of those rats were detected.ResultsLRIP could improve behavioral score，decrease the area of cerebral infarction，increase the concentration of NO and the SOD activity in serum of MCAO rats.ConclusionLRIP can relieve cerebral ischemia-reperfusion injury of MCAO rats under acute hyperglycemia.

Key words:limb remote ischemia-postconditioning; acute hyperglycemia; ischemia-reperfusion injury; SOD; NO; rat

作者簡(jiǎn)介:陳剛領(lǐng)(1980－)，男，博士，講師，研究方向:心腦血管藥理學(xué)，Tel: 025-86185127，E-mail: chengangling@ cpu.edu.cn

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81473317) ;中國(guó)藥科大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(No 2015PY016) ;江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PAPD) ;大學(xué)生創(chuàng)新藥物研制能力提高項(xiàng)目(No J1030830) ;江蘇省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)?新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目

收稿日期:2015－01－30，修回日期:2015－03－05

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001－1978(2015) 06－0780－05中國(guó)圖書分類號(hào): R-332; R322.81; R323.7; R587.1; R743.31; R977.3

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.009