8-異丙胺亞甲基橙皮素(IPHP)在Caco-2細(xì)胞模型上跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的研究

胡婷婷，黃　成，孟曉明，陳昭琳，沈陳林，李　俊

(安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽天然藥物活性研究省級實(shí)驗(yàn)室，安徽省創(chuàng)新藥物產(chǎn)業(yè)共性研究院，安徽合肥　230032)

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8-異丙胺亞甲基橙皮素(IPHP)在Caco-2細(xì)胞模型上跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的研究

胡婷婷，黃成，孟曉明，陳昭琳，沈陳林，李俊

(安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽天然藥物活性研究省級實(shí)驗(yàn)室，安徽省創(chuàng)新藥物產(chǎn)業(yè)共性研究院，安徽合肥230032)

摘要:目的利用Caco-2細(xì)胞模型研究8-異丙胺亞甲基橙皮素(IPHP)在小腸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制。方法在Caco-2細(xì)胞模型上進(jìn)行IPHP的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，探討藥物濃度、pH、溫度、P-gp抑制劑維拉帕米、MRP2抑制劑MK-571和丙磺舒對IPHP在體外細(xì)胞模型上跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。結(jié)果IPHP在Caco-2細(xì)胞模型上的轉(zhuǎn)運(yùn)具有一定的濃度依賴性，IPHP不同濃度從A側(cè)到B側(cè)的滲透系數(shù)P(app)(AP-BL) (×10(－5))分別為: (2.21±0.200)、(3.56±0.306)、(3.81±0.179)、(4.23±0.229)、(4.17±0.262) cm·s(－1)，B側(cè)到A側(cè)的滲透系數(shù)P(app)(BL-AP) (×10(－5))分別為: (3.57±0.209)、(4.51±0.113)、(4.97±0.229)、(5.24±0.550)、(5.07± 0.557) cm·s(－1)，外排率分別為:1.61、1.26、1.3、1.23、1.21。溫度和pH對其轉(zhuǎn)運(yùn)均有影響，而P-gp抑制劑對于IPHP的轉(zhuǎn)運(yùn)沒有明顯的影響，MRP2抑制劑在一定程度上增加了IPHP的轉(zhuǎn)運(yùn)量(P＜0.05)。結(jié)論IPHP在Caco-2細(xì)胞模型上的轉(zhuǎn)運(yùn)方式主要是被動擴(kuò)散，且其轉(zhuǎn)運(yùn)不受P-gp外排蛋白影響，而外排蛋白MRP2可能參與了IPHP的外排轉(zhuǎn)運(yùn)。

關(guān)鍵詞:IPHP; Caco-2細(xì)胞;吸收;外排;滲透系數(shù);被動擴(kuò)散;高效液相色譜

橙皮素(hesperetin)為蕓香科植物柑橘屬植物果實(shí)提取物，是廣泛存在于柚子和橙子中二氫黃酮類化合物，具有廣泛的藥理學(xué)特性，包括抗炎、抗氧化、抗腫瘤形成與生長等活性［1－3］。橙皮素口服以后生物利用度較好，但是半衰期較短，口服給藥以后體內(nèi)消除較快，為了維持有效血藥濃度，需要頻繁給藥，這一缺點(diǎn)限制了其在臨床上的應(yīng)用［4］。為了克服這一缺點(diǎn)，本課題組通過化學(xué)合成的方法，合成了一系列的橙皮素衍生物并對其藥理活性進(jìn)行了篩選。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，7，3'-二甲氧基橙皮素(7，3' -dimethoxy hesperetin，DMHP)具有較強(qiáng)抗炎活性，對AA大鼠繼發(fā)性炎癥具有良好的治療作用［5－7］。前期研究還發(fā)現(xiàn)8-異丙胺亞甲基橙皮素(IPHP，見Fig1)，在體外具有良好的抗炎活性，對于由LPS刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α和IL-6具有明顯的抑制作用。該實(shí)驗(yàn)利用Caco-2細(xì)胞模型來模擬小腸上皮細(xì)胞對IPHP的吸收情況，通過對Caco-2細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如P糖蛋白(P-gp)、多藥耐藥蛋白(MRP2)的研究來探討其吸收及外排機(jī)制，為之后的藥理學(xué)研究提供依據(jù)，為新型藥物單體的合成提供信息指導(dǎo)，為將來的臨床前研究提供資料。

3'，5，7-trihydroxy-8-isopropylaminomethyl-4'-methoxyflavanone (IPHP)Fig 1 Structure of IPHP

1　材料與方法

1.1細(xì)胞、藥品與試劑Caco-2細(xì)胞株購于武漢博士德公司，傳代數(shù)為30代; IMDM(博士德公司，批號: 04D24C59)，胰蛋白酶(博士德公司，批號: 03C28C15) ; DMSO，美國Gibco公司; Hanks液(碧云天) ; IPHP(本實(shí)驗(yàn)室合成，純度＞95%) ;橙皮素對照品(西安小草植物科技有限責(zé)任公司，純度＞98%，批號: XC1009018) ;橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所，純度＞98%，批號: 110721-200613) ; MK-571和丙磺舒(美國Sigma公司) ;維拉帕米(NICPBP，批號: 100223200102) ;甲醇為色譜純;水為雙蒸水，其余所有試劑為分析純。

1.2儀器LC-20A四元低壓梯度液相色譜儀(日本島津公司) ; XW-80A微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司) ; Neofuge23R臺式高速冷凍離心機(jī)(力康發(fā)展有限公司) ; DZE-6050型真空干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司) ; SHA-C水浴恒溫振蕩箱器(江蘇金壇億通電子有限公司) ;酶標(biāo)儀，荷蘭雷勃公司產(chǎn)品;懸掛式培養(yǎng)皿(Millicell-CPI) ; DDs-12A數(shù)字電導(dǎo)儀(Millicell-ERS) (美國Millipore公司) ; SW-CJ-IF型超凈臺，江蘇蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品; NAPCO-6100型細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國SHELLAB公司產(chǎn)品;高速離心機(jī)(珠海黑馬公司)。

1.3Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)及其單層的制備Caco-2細(xì)胞接種在12孔Millicell-CPI培養(yǎng)板上(底面積: 1.13 cm2，微孔: 3 μm)，種植密度為1×105cells· cm－2，在A側(cè)和B側(cè)分別加0.6 mL及1.2 mL的培養(yǎng)基放入37℃孵箱中孵育。每隔1天換1次液，培養(yǎng)約3周達(dá)到匯合、分化形成單細(xì)胞層。Caco-2細(xì)胞生長、匯合、分化在Millicell CPI膜上，細(xì)胞單層的緊密性與完整性是藥物轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。用顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長形態(tài)，同時(shí)每次換液時(shí)需要用DDs-12A數(shù)字電導(dǎo)儀測量跨膜電阻值(transepithelial electrical resistance，TEER)，當(dāng)TEER＞350 Ω ·cm2時(shí)細(xì)胞可用于實(shí)驗(yàn)。

1.4MTT實(shí)驗(yàn)Caco-2細(xì)胞按照一定的密度接種于96孔板中，放入37℃孵箱中培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，分別加入IPHP濃度為7.5、15、30、60、120、240、480 μmol·L－1的200 μL的培養(yǎng)液，37℃孵育24 h后，每孔再加入20 μL MTT溶液(5 g·L－1，即0.5% MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值(A)，計(jì)算細(xì)胞存活率(IC) : IC/%=(試驗(yàn)組A均值－調(diào)零空A均值)/(對照組A均值－調(diào)零空A均值)×100%。選取細(xì)胞存活率在80%以上的藥物濃度作為實(shí)驗(yàn)所需的安全濃度。

1.5轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)Caco-2細(xì)胞在Millicell-CPI培養(yǎng)板上形成緊密完整的單細(xì)胞層后，各孔貼側(cè)壁加入37℃的Hanks液，蕩洗細(xì)胞3次。吸干各孔內(nèi)Hanks液，在不破壞單細(xì)胞的基礎(chǔ)上祛除細(xì)胞表面的雜質(zhì)，之后用Hanks液于37℃孵育30 min。將IPHP溶于DMSO制備成240 mmol·L－1的溶液，用Hanks液稀釋至7.5、15、30、60、120 μmol·L－1的IPHP溶液。其中DMSO的濃度小于0.1%將不會影響單細(xì)胞層的完整性。孵育結(jié)束以后，在單層細(xì)胞膜內(nèi)的一側(cè)加入含藥Hanks溶液，另一側(cè)加入空白Hanks液，空白對照孔在兩側(cè)均加Hanks液。當(dāng)研究藥物分子從A側(cè)向B側(cè)方向轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)，A側(cè)加0.6 mL含IPHP的Hanks轉(zhuǎn)運(yùn)液，B側(cè)加入1.2 mL Hanks液，當(dāng)研究藥物分子從B側(cè)向A側(cè)方向轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)，A側(cè)加0.6 mL Hanks液，B側(cè)加1.2 mL含IPHP的Hanks液，分別于0、30、60、90和120 min時(shí)從A側(cè)及B側(cè)取轉(zhuǎn)運(yùn)液置于1.5 mL離心管中，放入－20℃冰箱中保存待測。為了探究pH對于IPHP轉(zhuǎn)運(yùn)吸收的影響，將含IPHP(120 μmol·L－1)的Hanks液分別在pH 5.5或pH 9.0條件下進(jìn)行吸收轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程同上所述。探究溫度是否對IPHP的吸收有影響，將含IPHP (120 μmol·L－1)的Hanks分別在4℃和37℃情況下按上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。

IPHP在Caco-2細(xì)胞的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)是否涉及到某些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的介導(dǎo)，需要我們進(jìn)一步研究。將P-gp抑制劑維拉帕米(50 μmol·L－1)，MRP2抑制劑MK-571(50 μmol·L－1)和丙磺舒(1 mmol·L－1)分別溶于Hanks液中。轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)之前，將Caco-2細(xì)胞單層模型用含有抑制劑的Hanks液于37℃孵育30 min，之后按照上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

1.6樣品分析本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法分析樣品，色譜柱: Phenomenex Luna C18柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm) ;流動相:乙腈－0.5%甲酸梯度洗脫(0～5 min，76∶24; 5～15 min，76∶24～30∶70; 15～16 min，30∶70～76∶24; 16～24 min，76∶24) ;檢測波長: 288 nm;流速: 1.0 mL/min;柱溫: 40℃;進(jìn)樣量:20 μL。

Tab 1 The IC(%) value at different IPHP concentration(±s，n=5)

Tab 1 The IC(%) value at different IPHP concentration(±s，n=5)

Concentration/μmol·L－17.5　15　30　60　120　240　480 IC/%　98.74±1.21　93.32±1.22　87.52±7.21　86.51±12.23　80.30±4.58　79.26±15.53　65.26±7.14

1.7數(shù)據(jù)分析藥物分子透過單細(xì)胞層的表觀滲透系數(shù):表觀滲透系數(shù)計(jì)算公式為: Papp=(dQ/dt)/A×C0，其中dQ/dt是單位時(shí)間內(nèi)藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)量(nmol·s－1)，A是聚碳酯膜的表面積，C0為供給室中待測物的初始濃度。外排率計(jì)算公式為: ER=Papp(BL－AP)/Papp(AP－BL)。所有數(shù)據(jù)以±s表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用One-Way ANOVA檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1Caco-2細(xì)胞單層膜完整性在顯微鏡下觀察Caco-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)的完整性，可觀察到Caco-2細(xì)胞形成致密的緊密連接，細(xì)胞融合成連續(xù)的單層。用DDS-12A數(shù)字電導(dǎo)儀測量跨膜電阻(transepithelial electrical resistance，TEER)，檢測到TEER均大于350 Ω·cm2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明Caco-2細(xì)胞已經(jīng)形成了完整的單細(xì)胞層，可以用于藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

2.2MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果Caco-2細(xì)胞在IPHP濃度為7.5、15、30、60、120、240、480 μmol·L－1在24 h的存活率分別為: 98.74%、93.32%、87.52%、86.51%、80.30%、79.26%、65.26%。由Tab 1結(jié)果可知，當(dāng)IPHP的藥物濃度小于120 μmol·L－1時(shí)，細(xì)胞的存活率大于80%。因此，本實(shí)驗(yàn)所采用的藥物濃度低于120 μmol·L－1，此時(shí)藥物對細(xì)胞的作用在安全濃度范圍內(nèi)。

2.3IPHP在Caco-2上的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)

2.3.1藥物濃度對IPHP轉(zhuǎn)運(yùn)的影響采用高效液相色譜法檢測標(biāo)準(zhǔn)品、空白Hanks液、空白Hanks加橙皮素，IPHP和內(nèi)標(biāo)橙皮苷、IPHP在Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)樣品的色譜圖見Fig 2，空白Hanks不干擾測定。高效液相色譜法測定不同時(shí)間點(diǎn)不同濃度下單細(xì)胞層兩側(cè)培養(yǎng)液中IPHP的濃度，結(jié)果見Fig 3。隨著藥物濃度的增加，Caco-2細(xì)胞對IPHP的攝取量逐漸增加，并且外排率ER分別為: 1.61、1.26、1.30、1.23、1.21。結(jié)果見Tab 2。

Fig 2　HPLC chromatograms of standard hesperidin，IPHP and hesperitin (A)，blank Hanks (B)，blank Hanks sample spiked with hesperedin，IPHP and hesperetin (C)，Hanks sample obtained 30 min after transport of IPHP from A to B?side (D).

Fig 3 Cumulative amount-time curve of IPHP inCaco-2 cell model(A→B and B→A，±s，n=3)

Tab 2 Effect of concentration on Pappof IPHP across Caco-2 cell monolayers (±s，n=3)

Tab 2 Effect of concentration on Pappof IPHP across Caco-2 cell monolayers (±s，n=3)

Bi-directional apparent permeability coefficients (Papp) of IPHP across Caco-2 cell monolayers.

InitialPapp(APBL)Papp(BLAP)Papp(BLAP)/Compoundconcentrations→　→　→/μmol·L－1/×10－5cm·s－1/×10－5cm·s－1Papp(AP→BL) 7.5　2.21±0.200　3.57±0.209　1.61 15　3.56±0.306　4.51±0.113　1.26 IPHP　30　3.81±0.179　4.97±0.229　1.30 60　4.23±0.229　5.24±0.550　1.23 120　4.17±0.262　5.07±0.557　1.21

2.3.2pH對IPHP轉(zhuǎn)運(yùn)的影響pH對藥物的吸收的結(jié)果如Fig 4所示，pH 5、pH 7.4和pH 9的Papp(AP－BL) (×10－5)和Papp(BL－AP) (×10－5)分別為: (1.47±0.111) cm·s－1和(1.98±0.354) cm ·s－1; (4.23±0.229) cm·s－1和(5.24±0.550) cm·s－1; (3.01±0.262) cm·s－1和(3.77± 0.412) cm·s－1。在pH 7.4的環(huán)境下藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)量明顯大于pH 5(P＜0.01)和pH 9 (P＜0.05)。結(jié)果表明，IPHP在中性環(huán)境中吸收情況要優(yōu)于在酸性和堿性條件下，這可能與IPHP的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有關(guān)，其在中性環(huán)境中吸收更好。

Fig 4　Effect of pH on PappofIPHP across Caco-2 cell monolayers±s，n=3)

2.3.3溫度對IPHP轉(zhuǎn)運(yùn)的影響溫度主要影響ATP依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性，可能對IPHP在Caco-2細(xì)胞上的轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生一定的影響。因此本實(shí)驗(yàn)將探討IPHP在4℃和37℃溫度條件下的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)情況，結(jié)果見Fig 5。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，37℃條件下IPHP的Papp(AP－BL) (×10－5)和Papp(BLAP) (×10－5)分別為［4.23±0.229］cm·s－1和(5.24±0.550) cm·s－1，而4℃條件下其Papp(AP－BL) (×10－5)和Papp(BL－AP) (×10－5)分別為(3.21±0.626) cm·s－1和(4.17±0.354) cm· s－1。37℃環(huán)境下的AP到BL側(cè)和BL到AP側(cè)的滲透率均高于4℃環(huán)境(P＜0.05)，說明IPHP在Caco-2細(xì)胞上的轉(zhuǎn)運(yùn)受溫度的影響，可能與相關(guān)ATP依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān)。

Fig 5 Effect of temperature on PappofIPHP across Caco-2 cell monolayers±s，n=3)

Fig 6　Effect of transporter inhibitor on Pappof IPHP across Caco-2 cell monolayers (±s，n=3)

2.3.4抑制劑對藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的影響我們?yōu)榱颂接戅D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用，加入了一系列的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑，如P-gp抑制劑維拉帕米、MRP2抑制劑MK-571和丙磺舒，來觀察轉(zhuǎn)運(yùn)蛋?白對IPHP吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，結(jié)果見Fig 6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)加?入P-gp抑制劑維拉帕米時(shí)，藥物滲透系數(shù)Papp(AP－BL) (× 10－5)和Papp(BL－AP) (×10－5)為(4.33±0.79) cm·s－1和(5.32±0.94) cm·s－1，相較于正常細(xì)胞組未發(fā)生明顯變化(P＞0.05)。而加入MRP2抑制劑MK-571和丙磺舒的組藥物滲透率Papp(APBL) (×10－5)和Papp(BL－AP) (×10－5)分別為(5.87±0.96) cm·s－1和(3.97±1.12) cm·s－1; (5.45±1.82) cm·s－1和(3.79±0.87) cm· s－1，由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，Papp(BL－AP) (×10－5)值均比Papp(AP－BL) (×10－5)值大，且相較于正常組，外排量明顯降低(P＜0.05)，吸收量明顯增加(P＜0.05)。說明加入抑制劑后，某些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白受到了一定程度的抑制，導(dǎo)致外排量下降，吸收量增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IPHP在Caco-2細(xì)胞上的轉(zhuǎn)運(yùn)可能與MRP2有關(guān)，而與P-gp無關(guān)。

3　討論

Caco-2細(xì)胞是人克隆結(jié)腸腺癌細(xì)胞，在適宜的培養(yǎng)條件下，將Caco-2細(xì)胞種在多孔的可滲透性聚碳酸酯膜上，經(jīng)過21 d的融合分化可形成連續(xù)的單層。Caco-2細(xì)胞與人小腸上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上相似，具有相同的細(xì)胞極性和緊密連接;此外，Caco-2細(xì)胞含有與小腸刷狀緣上皮相似的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，例如外排蛋白P-gp、MRP2等［8－11］。因此，Caco-2細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，用以預(yù)測藥物在人小腸的吸收的情況，較之體內(nèi)的動物實(shí)驗(yàn)具有簡單、方便、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，更適合于藥物的高通量篩選。

本實(shí)驗(yàn)采用Caco-2單層細(xì)胞模型，模擬IPHP在腸道的吸收情況，探討IPHP在腸道吸收的機(jī)制。MTT實(shí)驗(yàn)篩選出合適的用于轉(zhuǎn)運(yùn)的藥物濃度，在安全濃度范圍內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)，IPHP在Caco-2細(xì)胞上的轉(zhuǎn)運(yùn)具有濃度依賴性，且隨著濃度的增加其轉(zhuǎn)運(yùn)量逐漸增加，說明IPHP的吸收可能以被動轉(zhuǎn)運(yùn)為主。IPHP不同濃度從A側(cè)到B側(cè)的滲透系數(shù)Papp(AP－BL) (×10－5)分別為: (2.21± 0.200) cm·s－1，(3.56±0.306) cm·s－1，(3.81± 0.179) cm·s－1，(4.23±0.229) cm·s－1，(4.17± 0.262) cm·s－1，B側(cè)到A側(cè)的滲透系數(shù)Papp(BLAP) (×10－5)分別為: (3.57±0.209) cm·s－1，(4.51±0.113) cm·s－1，(4.97±0.229) cm·s－1，(5.24±0.550) cm·s－1，(5.07±0.557) cm·s－1，外排率分別為:1.61，1.26，1.30，1.23，1.21。在Caco-2細(xì)胞模型中藥物分子的表觀滲透系數(shù)與口服吸收相關(guān)聯(lián)。有文獻(xiàn)報(bào)道［12－13］，當(dāng)藥物的表觀滲透系數(shù)大于1×10－6cm·s－1時(shí)，其表現(xiàn)出良好的吸收性。吸收較好藥物的表觀滲透系數(shù)在0.1～1× 10－6cm·s－1，而吸收差的藥物，其表觀滲透系數(shù)小于1×10－7cm·s－1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藥物IPHP的吸收良好，ER在0.5～1.5之間，差異不大，進(jìn)一步說明IPHP的轉(zhuǎn)運(yùn)方式主要是被動轉(zhuǎn)運(yùn)。pH 7.4條件下IPHP的轉(zhuǎn)運(yùn)量高于pH 5.0和pH 9.0，說明藥物在中性環(huán)境中的更容易被吸收，這可能與藥物IPHP的中性結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有關(guān)，IPHP結(jié)構(gòu)中4位羰基與5位羥基易形成氫鍵，7位羥基和氨基容易形成氫鍵，3'位羥基與甲氧基的氧在空間結(jié)構(gòu)上也容易形成5元環(huán)氫鍵，這些氫鍵都是分子內(nèi)氫鍵，同時(shí)5，6元環(huán)比較穩(wěn)定，使得分子趨于穩(wěn)定，從而可能表現(xiàn)出中性的性質(zhì)。藥物在中性狀態(tài)下溶解更加，更容易被吸收。IPHP在4℃時(shí)的轉(zhuǎn)運(yùn)量相較于37℃明顯減少，說明溫度對IPHP的吸收是有影響的，可能與相關(guān)ATP依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān)。加入了P-gp抑制劑維拉帕米后，IPHP的轉(zhuǎn)運(yùn)量相較于正常組并無明顯差異，說明P-gp并未參與IPHP的轉(zhuǎn)運(yùn)，而加入了MRP2抑制劑MK-571和丙磺舒的兩組，Papp(BL－AP)值相較于正常組明顯降低，Papp(APBL)值明顯增加。說明MRP2可能參與了IPHP在Caco-2細(xì)胞上的轉(zhuǎn)運(yùn)，但是MK-571和丙磺舒并非專一性的MRP2抑制劑，其對BCRP等外排蛋白也有抑制作用，因此我們認(rèn)為MRP2可能參與了IPHP的外排。

綜上所述，IPHP在Caco-2細(xì)胞模型上以被動轉(zhuǎn)運(yùn)的吸收方式為主，同時(shí)可能有MRP2等相關(guān)外排蛋白介導(dǎo)其轉(zhuǎn)運(yùn)，且具有較好的吸收特性。

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Transportation of 8-isopropylaminomethyl hesperitin(IPHP) across human intestinal epithelial by using Caco-2 cells

HU Ting-ting，HUANG Cheng，MENG Xiao-ming，CHEN Zhao-lin，SHEN Chen-lin，LI Jun
(School of Pharmacy，Anhui Key Laboratory of Bioactivity of Natural Products，Anhui Institute of Innovative Drugs，Anhui Medical University，Hefei 230032，China)

Abstract:AimTo study the mechanism of 8-isopropylaminomethyl hesperitin (IPHP) intestinal absorption using Caco-2 cell lines.Methods Using Caco-2 cell lines as an intestinal epithelial cell model，the effects of drug concentration，temperature，pH，P-glycoprotein (P-gp) inhibitor verapamil and multidrug resistance protein 2 (MRP2) inhibitors MK-571 or probenecid on IPHP transport across Caco-2 cell lines were all investigated.ResultsThe transportation of IPHP was related to drug concentration.The P(app)(APBL) (×10(－5)) was (2.21±0.200) cm·s(－1)，(3.56 ±0.306) cm·s(－1)，(3.81±0.179) cm·s(－1)，(4.23 ±0.229) cm·s(－1)，(4.17±0.262) cm·s(－1)，respectively，and P(app)(BL-AP) (×10(－5)) was (3.57± 0.209) cm·s(－1)，(4.51±0.113) cm·s(－1)，(4.97± 0.229) cm·s(－1)，(5.24±0.550) cm·s(－1)，(5.07± 0.557) cm·s(－1)，respectively.Efflux rate was 1.61，1.26，1.3，1.23，1.21，respectively.Temperature and pH both influenced the transport，While the P-gp inhibitor verapamil had no effect on the transport of IPHP.MRP2 inhibitors MK-571 or probenecid led to an apparent decrease in the efflux of IPHP.ConclusionThe results suggest that the transport of IPHP is mainly passive diffusion，and MRP2 but not P-gp may be involved in the transport of IPHP.

Key words:IPHP; Caco-2 cell; intestinal absorption; efflux; apparent permeability coefficients; passive diffusion;HPLC

作者簡介:胡婷婷(1988－)，女，碩士生，研究方向:生物藥劑學(xué)，E-mail: anhuihtt@ 163.com;李俊(1960－)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:臨床藥理學(xué)、抗炎免疫藥理學(xué)、藥代動力學(xué)，E-mail: lj@ ahmu.edu.cn

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81273526) ;安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目(No 1301042212) ;安徽省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 1206c0805026) ;安徽醫(yī)科大學(xué)博士科研啟動基金(No XJ201118)

收稿日期:2015－01－19，修回日期:2015－03－20

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1001－1978(2015) 06－0769－06中國圖書分類號: R284.1; R322.45; R329.24

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.007