磺胺類藥物單鏈抗體的制備及其與磺胺噻唑相互作用研究

李永翰等

摘 要 抗體與對(duì)應(yīng)的小分子待測物之間的相互作用模式?jīng)Q定了免疫分析的特性。本研究以磺胺類藥物雜交瘤細(xì)胞株4C7為起點(diǎn)，應(yīng)用基因工程技術(shù)制備出單鏈抗體scFv4C7，采用間接競爭ELISA法對(duì)比其與母本單克隆抗體的識(shí)別特性，同時(shí)采用同源建模構(gòu)建scFv4C7的三維立體結(jié)構(gòu)，并與磺胺噻唑（STZ）進(jìn)行分子對(duì)接。間接競爭ELISA結(jié)果顯示scFv4C7保留了親本單克隆抗體的識(shí)別特性，分子對(duì)接結(jié)果顯示STZ深陷入抗體的重鏈和輕鏈形成的“口袋”中，STZ分子更靠近重鏈，且主要與抗原互補(bǔ)決定區(qū)CDR H3相互作用。本研究為制備識(shí)別譜更廣、親和力更高的磺胺類藥物抗體提供了必要的結(jié)構(gòu)信息。

關(guān)鍵詞 相互作用； 同源建模； 分子對(duì)接； 單鏈抗體； 磺胺噻唑

1 引 言

磺胺類藥物（Sulfonamides， SAs）是目前應(yīng)用范圍最廣、用量最大、種類最多的抗菌藥物之一，其不合理使用在食品和環(huán)境中造成的殘留給人類健康帶來潛在危害。基于抗原抗體特異性反應(yīng)的免疫分析具有靈敏度高、操作簡便、成本低且適合現(xiàn)場快速檢測而越來越受到重視。磺胺類藥物多特異性抗體已有很多報(bào)道[1～2]，這些抗體識(shí)別磺胺類藥物的種類存在顯著差異，難以應(yīng)用于磺胺類藥物的多殘留檢測。研究磺胺類藥物與抗體之間的識(shí)別機(jī)制，探討影響抗體識(shí)別的關(guān)鍵因素，對(duì)磺胺類藥物半抗原設(shè)計(jì)的進(jìn)行改進(jìn)從而制備出性能更加優(yōu)良的抗體具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

單鏈抗體（Single chain variable fragment， scFv）是抗體分子中保留抗原結(jié)合部位的最小功能片段，以scFv為研究對(duì)象，通過同源建模、分子對(duì)接和構(gòu)效關(guān)系等方法來研究抗原抗體之間的相互作用，可為了解抗體識(shí)別機(jī)制提供必要的結(jié)構(gòu)信息 [3～6]。Wang等構(gòu)建了河豚毒素的scFv，并通過同源建模和分子對(duì)接研究了scFv和河豚毒素的相互作用，預(yù)測相互作用的兩個(gè)必需氨基酸為K183和I189，通過定點(diǎn)突變驗(yàn)證了該預(yù)測的可靠性[4]。He等利用基因工程技術(shù)將抗黃體酮scFv中的關(guān)鍵氨基酸W100定點(diǎn)突變成其它15種氨基酸，發(fā)現(xiàn)突變體與野生型scFv的特異性和親和力存在明顯差異，其中，將W100突變成R100后顯著提高了抗體對(duì)孕酮衍生物（Progesterone3CMO）的親和力[5]，證明可通過基因工程技術(shù)改變結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)鍵氨基酸來改變抗體的識(shí)別能力，并可能獲得親和力更高的抗體。

本研究通過制備磺胺類藥物單克隆抗體4C7對(duì)應(yīng)的scFv，利用同源建模和分子對(duì)接，通過實(shí)驗(yàn)研究和理論分析對(duì)磺胺噻唑與4C7的相互作用進(jìn)行了初步研究，為全面了解4C7的識(shí)別機(jī)制、制備識(shí)別譜更廣的磺胺類藥物抗體奠定了基礎(chǔ)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

2720型PCR擴(kuò)增儀（美國ABI公司）； HQ60Ⅱ型漩渦混合器（北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司）； HDLAPPARATUS超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）； MiniPROTEAN4蛋白電泳設(shè)備（美國BioRad公司）； GHP9160A隔水式恒溫培養(yǎng)箱（北京陸希科技有限公司）； H2C250恒溫振蕩培養(yǎng)箱（蘇州市培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）； Thermo Scientific Multiskan MK3酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

磺胺類藥物雜交瘤細(xì)胞株4C7和單克隆抗體Mab4C7由本實(shí)驗(yàn)室制備[2]； pJB33載體由本實(shí)驗(yàn)室保存； RV308菌種來自于美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心； Qiagen RNeasy Mini kit、QIAshredder（Qiagen公司）； SuperScriptTM FirstStrand Synthesis System for RTPCR（Invitrogen公司）； 異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、Wizard DNA Cleanup System（Promega公司）； 限制性內(nèi)切酶SfiⅠ（美國NEB公司）； T4 DNA連接酶、Ex Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker （TaKaRa公司）； HisTrap HP組氨酸標(biāo)記親和層析柱（GE Healthcare）； Amicon Ultra離心超濾管（Millipore公司）； 羊抗鼠HRP標(biāo)記抗體、抗cmyc抗體9E10（Jackson ImmunoResearch公司）； 磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品（SigmaAldrich公司）； 96孔酶標(biāo)板（Costar公司）； 競爭ELISA中的緩沖液參照文獻(xiàn)[2]介紹； 其它生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

2.2 引物合成

參照文獻(xiàn)[7]設(shè)計(jì)鼠源抗體重鏈及輕鏈可變區(qū)的擴(kuò)增引物，連接肽Linker采用Huston等[8]介紹的（Gly4Ser）3形式，并在引物序列上設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)以及保護(hù)堿基等基因附件（表1）。所有引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 雜交瘤細(xì)胞總RNA提取及cDNA的合成 培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞株4C7至對(duì)數(shù)生長期，細(xì)胞計(jì)數(shù)約107個(gè)時(shí)收集細(xì)胞，用試劑盒提取總RNA，取5 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定完整性，以提取的RNA為模版，利用SuperScriptTM FirstStrand Synthesis System for RTPCR合成cDNA。

2.3.2 VH、VL基因的克隆及scFv基因片段的拼接 以cDNA為模板，采用巢式PCR技術(shù)，分別以VHF1和VHR1為第一輪PCR引物，VHF2和VHR2為第二輪PCR引物，VHF2和VHR3為第三輪PCR引物，擴(kuò)增出VH。分別以VLF1和VLR1為第一輪PCR引物，VLF2和VLR2為第二輪PCR引物擴(kuò)增出VL。PCR反應(yīng)體系按常規(guī)比例配成25 μL（反應(yīng)程序： 94 ℃， 5 min； 94 ℃， 20 s； 55 ℃， 20 s； 72 ℃， 20 s； 72 ℃， 10 min； 共30次循環(huán)）。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定， 回收目的片段， 獲得VH和VL基因。endprint

取等摩爾純化的VH、VL， 以VLF2和VHR3分別為上、下游引物， 通過重疊延伸PCR完成VLLinkerVH片段的拼接（拼接程序： 95 ℃， 5 min； 95 ℃， 1 min； 55 ℃， 2 min； 72 ℃， 1 min； 72 ℃， 10 min； 共30個(gè)循環(huán)）， 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物， 切膠回收獲得VLLinkerVH基因片段， 即為全長scFv。

2.3.3 scFvpJB33表達(dá)載體的構(gòu)建

將scFv基因片段、pJB33載體分別用SfiⅠ雙酶切，回收目的片段。將雙酶切后的scFv（60 ng）和表達(dá)載體pJB33（100 ng）在T4 DNA Ligase作用下，25 ℃連接3 h。取20 μL的連接體系電擊轉(zhuǎn)化RV308感受態(tài)細(xì)胞，涂含34 mg/L氯霉素的2×YT平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取菌落，接種于含氯霉素的2×YT液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)3 h后送金唯智生物科技（北京）有限公司測序。選擇測序正確的菌落進(jìn)行保種，備誘導(dǎo)表達(dá)用。

2.3.4 單鏈抗體的可溶性表達(dá)及純化

在非變性條件下提取scFv， 并利用固定化金屬親和層析（IMAC）純化：將構(gòu)建好的表達(dá)載體接種于含34 mg/L氯霉素的2×YT液體培養(yǎng)基中，37 ℃，250 r/min培養(yǎng)至OD600=0.5～1.0時(shí)，加入IPTG至0.25 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)（16 ℃，150 r/min，16 h）。采用HisTrap HP組氨酸標(biāo)記親和層析柱純化scFv4C7，用超濾管對(duì)獲得的抗體溶液除鹽和濃縮，SDSPAGE鑒定其大小。

2.3.5 單鏈抗體交叉反應(yīng)率的測定

采用優(yōu)化好的間接競爭ELISA 方法[2]，測定scFv4C7對(duì)磺胺類藥物的識(shí)別特性。并計(jì)算得到各競爭物的IC50和各競爭物對(duì)scFv4C7的交叉反應(yīng)率。

2.3.6 同源建模和分子對(duì)接 將scFv基因序列提交至ExPASy數(shù)據(jù)庫，得到相應(yīng)的氨基酸序列。利用abYsis數(shù)據(jù)庫在線工具分析scFv的VH和VL序列。采用SwissModel和Autodock 4.0進(jìn)行同源建模和分子對(duì)接，由PyMOL獲得三維結(jié)構(gòu)圖像，由LigPlus獲得結(jié)合位點(diǎn)的作用力信息。

3 結(jié)果與討論

3.1 磺胺類藥物雜交瘤細(xì)胞總RNA提取

使用RNA提取試劑盒從雜交瘤細(xì)胞中提取總RNA，1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行RNA電泳檢測，如圖1A所示，可清晰地觀察到兩條帶：28 S和18 S，說明提取的總RNA完整度良好。

3.2 VH、VL和scFv基因片段的擴(kuò)增鑒定

將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模版，分別擴(kuò)增出VH和VL基因，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定并回收，如圖1B所示。將輕鏈與重鏈片段進(jìn)行重疊延伸PCR，通過Linker連接得到scFv片段，如圖1B所示。將測序正確的scFv目的片段和表達(dá)載體pJB33，分別用Sfi I雙酶切后連接，電擊轉(zhuǎn)化RV308感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建完整的表達(dá)載體。

3.3 單鏈抗體的可溶性表達(dá)及純化

將可溶性表達(dá)的單鏈抗體scFv4C7純化后用SDSPAGE鑒定，結(jié)果如圖2所示，顯示該其大小約25 kD，與預(yù)期結(jié)果一致。經(jīng)濃縮后獲得2.5 g/L的scFv4C7溶液。

3.4 單鏈抗體和單克隆抗體的生物學(xué)活性比較

間接競爭ELISA測定結(jié)果顯示scFv4C7的IC50和交叉反應(yīng)率與單克隆抗體Mab4C7基本一致，結(jié)果如表2所示，說明本研究制備的scFv具有與母本單克隆抗體一致的生物學(xué)活性。證明本研究克隆的Mab4C7可變區(qū)基因序列是正確的，可將其作為同源建模和分子對(duì)接的研究對(duì)象。

3.5.2 scFv4C7的同源建模 采用SwissModel構(gòu)建scFv4C7的空間三維模型[9～11]，如圖3B所示，包含VL（紫色），Linker（黃色）和VH（綠色）三部分。利用PROCHECK獲得Ramachandran plot，對(duì)模型中主鏈氨基酸殘基的二面角φ和ψ進(jìn)行合理性分析，初步評(píng)價(jià)模型的的可信度，如圖3C所示，分析結(jié)果顯示此同源模型中97%以上的氨基酸處于合理區(qū)域，證明此模型的可信度較高，具有較好的預(yù)測能力。

3.5.3 scFv4C7和STZ的分子對(duì)接 為了研究小分子與抗體的作用機(jī)制，本研究選擇scFv識(shí)別較好的STZ，利用Autodock 4.0對(duì)scFv4C7和STZ進(jìn)行分子模擬對(duì)接，如圖3D所示，重鏈和輕鏈形成一個(gè)較深的“口袋”，該“口袋”為抗原結(jié)合區(qū)，幾乎將小分子完全包圍。二者的結(jié)合位點(diǎn)如圖3E所示，輕鏈上的LAsn39，LTrp94，LArg51和重鏈上的HHis168， HTrp180， HAla229， HTyr231， HGly232和HGly233共同形成一個(gè)疏水型“口袋”，HARG230和HTRP235和STZ形成兩個(gè)分子間氫鍵。在這11個(gè)氨基酸中8個(gè)位于重鏈，據(jù)此推斷小分子與抗體結(jié)合時(shí)更靠近抗體的重鏈區(qū)域。在重鏈的抗原互補(bǔ)決定區(qū)（CDRs）中，CDR H3貢獻(xiàn)的關(guān)鍵氨基酸（Tyr231，Gly232，Gly233）最多，說明CDR H3可能是抗原結(jié)合區(qū)中最關(guān)鍵的部分。

通過對(duì)此分子對(duì)接模型的分析，發(fā)現(xiàn)了抗體中與磺胺噻唑結(jié)合的關(guān)鍵部位（CDR H3）、主要作用力類型（疏水作用力和氫鍵）和關(guān)鍵氨基酸（HARG230和HTRP235）。本研究為制備識(shí)別譜更廣、親和力更高的磺胺類藥物抗體提供了必要的結(jié)構(gòu)信息。

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Abstract The interaction between the antibody and the corresponding target molecule determines the characteristics of immunoassay. In this study， a single chain variable fragment antibody （scFv4C7） derived from the hybridoma strain 4C7 were prepared via genetic engineering technique. The recognition properties of scFv4C7 was determined and compared to those of the parent monoclonal antibody by indirect competitive enzymelinked immunosorbent assay（icELISA）. Three dimensional structure of the scFv4C7 was presented by SwissModel， and sulfathiazole （STZ） was docked to the scFv4C7 model to obtain the structure of the binding complex. The results from the icELISA showed that the binding properties of scFv4C7 were comparable with the parent monoclonal antibody and STZ was almost completely buried in a deep binding pocket formed by the heavy chain and light chain of the antibody. The interaction between STZ and scFv4C7 was more closely related to the heavy chain and the complementaritydetermining region （CDR） H3 loop played more important role than other CDR loops. The study preliminary provided the necessary structural information for the preparation of antibody with broader specificity and higher affinity.

Keywords Proteinligand interaction； Homology modeling； Molecular docking； Single chain variable fragment antibody； Sulfathiazole

（Received 23 July 2014； accepted 14 October 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.31372475）endprint