野生云南肉豆蔻種子形態(tài)變異與脂肪酸組成分析

張鳳良，李小琴，毛常麗，楊 湉，趙 祺，張 輝，吳 裕

(云南省熱帶作物科學(xué)研究所，云南 景洪 666100)

肉豆蔻科(Myristicaceae)肉豆蔻屬(Myristica)約150種，野生分布于東南亞及太平洋島嶼，我國熱區(qū)是肉豆蔻屬分布的北部邊緣。該屬的肉豆蔻(M.fragransHoutt.)是著名的香料和藥材，在熱帶地區(qū)廣泛栽培，種子含油率40%～73%，油中十四烷酸相對(duì)含量為80%～90%[1-5]。云南肉豆蔻(M.yunnanensisY. H. Li)是云南野生種，分布于西雙版納州和紅河州溝谷雨林地段，而西雙版納的種群數(shù)量較大，主要集中在海拔800 m以下溝谷或凹地，種子含油率不足10%[2-3]。據(jù)文獻(xiàn)資料記錄，云南肉豆蔻與肉豆蔻的種子含油率差異過大，云南肉豆蔻種子含肉豆蔻酸達(dá)66.79%，種群數(shù)量極少，面臨滅絕的危險(xiǎn)[6]。種子形態(tài)變異和脂肪酸的變異在一定程度上反映了群體的遺傳變異，分析云南肉豆蔻的脂肪酸組成和表型變異對(duì)其遺傳多樣性保護(hù)和資源利用都有重要意義。本文從云南省景洪市基諾鄉(xiāng)的天然林中采集野生云南肉豆蔻種子進(jìn)行種子形態(tài)、含油率、脂肪酸組成變異分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 種子來源與處理

2017年7月在云南肉豆蔻種子成熟的季節(jié)，從云南省景洪市基諾鄉(xiāng)天然林內(nèi)(100°90′～101°14′E，21°50′～21°58′N，海拔500～800 m)以株間距大于50 m的要求隨機(jī)選擇單株，從樹下拾取自然脫落而尚新鮮的種子，分單株編號(hào)記錄，編號(hào)為1～22號(hào)。種子帶回實(shí)驗(yàn)室，人工除去假種皮后，以鼓風(fēng)烘干箱36℃恒溫干燥至恒重，常溫通風(fēng)保存。

1.1.2 儀器與設(shè)備

B-815脂肪酸提取儀，瑞士步琪有限公司；HP6890GC/5973MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、6890N氣相色譜儀，美國Agilent Technologies公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子形態(tài)指標(biāo)測(cè)定

以烘干種子為材料，對(duì)每株樹的種子隨機(jī)抓取20粒，用游標(biāo)卡尺測(cè)量種長(zhǎng)和種寬，測(cè)量精度為0.01 mm；用電子天平測(cè)單粒重，測(cè)重精度為0.001 g；不足20粒者全部測(cè)定；不足15粒者不記入統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。測(cè)量數(shù)據(jù)計(jì)算變幅、均值、變異系數(shù)和種子長(zhǎng)寬比。

1.2.2 油脂提取

油脂提取于2017年7月在云南省熱帶作物科學(xué)研究所農(nóng)產(chǎn)品加工實(shí)驗(yàn)室完成。選取種皮完好無破損的種子，機(jī)械脫殼后剔除不飽滿、變色等劣質(zhì)種仁，機(jī)械破碎，研缽研細(xì)，以石油醚(AR級(jí)，30～60℃沸程)為溶劑，用B-815脂肪酸提取儀進(jìn)行油脂提取，揮干溶劑后獲取的油脂分別用2 mL離心管封裝，冷藏保存，直接送樣分析。

1.2.3 油脂脂肪酸組成與相對(duì)含量測(cè)定

油脂脂肪酸組成與相對(duì)含量測(cè)定于2017年8月委托中國科學(xué)院昆明植物研究所測(cè)試中心完成。取約50 mg油脂，加入20 mL 1%的硫酸甲醇溶液，水浴回流至油珠消失(約5 h)。將反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至室溫后加入3倍體積的蒸餾水，用乙醚萃取3次，合并乙醚萃取液用水洗至中性，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后蒸去部分乙醚，即得到該油的脂肪酸甲酯乙醚溶液。反應(yīng)產(chǎn)物直接進(jìn)樣作GC及GC-MS分析。

GC-MS分析條件：GC條件，DB-225MS石英毛細(xì)管柱(30 mm×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序?yàn)槠鹗紲囟?80℃，保持25 min，5℃/min升溫至220℃，保持20 min；柱流量1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度230℃；柱前壓100 kPa；進(jìn)樣量1.0 μL；分流比30∶1；載氣為高純氦氣。MS條件，電離方式EI；電子能量70 eV；傳輸線溫度250℃；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；質(zhì)量范圍35～500 u。采用Wiley7n.l標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索定性。

GC條件：DB-WAX石英毛細(xì)管柱(30 mm×0.32 mm×0.53 μm)；升溫程序?yàn)槠鹗紲囟?00℃，保持26 min，5℃/min升溫至220℃，保持20 min；柱流量1.5 mL/min；進(jìn)樣口溫度250℃；FID溫度250℃；進(jìn)樣量1.0 μL；分流比50∶1；載氣為高純氮?dú)?。采用氣相色譜峰面積歸一化法計(jì)算各成分的相對(duì)含量。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 云南肉豆蔻種子形態(tài)群體變異

對(duì)19株樹的種子測(cè)定數(shù)據(jù)計(jì)算單株內(nèi)的種長(zhǎng)、種寬、單粒重、長(zhǎng)寬比的變幅、均值、變異系數(shù)，再以單株的均值代表單株指標(biāo)進(jìn)行群體變異分析，結(jié)果見表1。從表1可以看出，種長(zhǎng)群體變幅為34.73～45.89 mm，種寬為20.36～26.54 mm，單粒重為7.67～16.86 g，長(zhǎng)寬比為1.63～2.11，相應(yīng)的變異系數(shù)分別為7.13%、5.95%、20.94%和7.27%。平均種長(zhǎng)最大值(45.89 mm)是最小值(34.73 mm)的1.32倍，變異系數(shù)僅為7.13%，種長(zhǎng)這一性狀的群體變異并不大；種寬的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)與此相近。種子長(zhǎng)寬比是表現(xiàn)種子總體形態(tài)的重要指標(biāo)，單株長(zhǎng)寬比最大值(2.11)是最小值(1.63)的1.29倍，變異系數(shù)為7.27%，說明種子的總體形態(tài)群體變異并不大。單粒重是群體變異最大的性狀，單株的最大值(16.86 g)是最小值(7.67 g)的2.20倍，變異系數(shù)為20.94%，群體變異較大。以372粒種子重與種長(zhǎng)和種寬進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)為0.727 1和0.620 8，達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。種子重與長(zhǎng)寬比的相關(guān)系數(shù)為0.047 5，即種子重與種子的總體形態(tài)無關(guān)。對(duì)19株樹的種子進(jìn)行株內(nèi)變異分析，結(jié)果種長(zhǎng)、種寬、單粒重和長(zhǎng)寬比的變異系數(shù)分別為3.75%～8.22%、3.19%～10.92%、10.71%～20.44%、3.01%～9.94%，也就說明株內(nèi)變異與株間變異相近?？傮w反映云南肉豆蔻在本居群內(nèi)種子表型的多樣性不豐富。

表1 云南肉豆蔻種子表型性狀變異統(tǒng)計(jì)

2.2 云南肉豆蔻種仁含油率變異

對(duì)20株樹的種子測(cè)定種仁含油率，再根據(jù)相應(yīng)的出仁率計(jì)算種子含油率，結(jié)果見表2。

表2 云南肉豆蔻種仁和種子含油率 %

從表2可知，20株樹的種仁含油率變幅為6.37%～15.83%，最大值是最小值的2.49倍，均值為11.47%，株間變異較大。種子含油率變幅為5.54%～14.83%，最大值是最小值的2.68倍，均值為10.40%。據(jù)《云南植物志》《中國植物志》和《Flora of China》記錄，種子含油率為6%～7%[1-3]。文獻(xiàn)記錄數(shù)據(jù)在本次研究變異范圍之內(nèi)，本次研究的含油率株間變異較大。

據(jù)研究，云南野生的風(fēng)吹楠(Horsfieldiaamygdalina)種仁含油率為60%左右[7]，滇南風(fēng)吹楠(H.tetratepala)的為50%～60%[8]，琴葉風(fēng)吹楠(H.pandurifolia)的為50%～70%[9]，分布于東南亞國家的肉豆蔻種子含油率為40%～73%[1]。與此相比，云南肉豆蔻種子的含油率相當(dāng)?shù)?。?7株樹的種仁含油率和種子含油率與單粒重、種寬和種長(zhǎng)進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)為-0.217 3～-0.371 4，表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)，但不顯著。由于含油率是受環(huán)境影響較大的性狀，植株所處的立地差異可能加大了含油率的株間變異。在20株樹中，第13號(hào)植株的種仁含油率為15.83%，種子含油率為14.83%，總體說來含油率最高。結(jié)合表1的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)第13號(hào)植株的平均種長(zhǎng)(40.85 mm)低于群體平均值(41.21 mm)，而種寬(23.72 mm)排名第2，平均單粒重(11.18 g)排名第4，即種子不算大，但發(fā)育飽滿。

2.3 云南肉豆蔻種仁油的脂肪酸組成

對(duì)20株樹種子的種仁油進(jìn)行脂肪酸組成分析，結(jié)果見表3。

注：“-”表示未檢測(cè)到該脂肪酸成分。

由表3可知，共檢測(cè)到14種常見脂肪酸，分別為十二烷酸(C12∶0)、十三烷酸(C13∶0)、十四烷酸(C14∶0)、十五烷酸(C15∶0)、十六碳烯酸(C16∶1)、十六烷酸(C16∶0)、十七烷酸(C17∶0)、十八碳二烯酸(C18∶2)、十八碳烯酸(C18∶1)、十八烷酸(C18∶0)、二十碳烯酸(C20∶1)、二十烷酸(C20∶0)、二十二烷酸(C22∶0)、二十四烷酸(C24∶0)，其中十八碳烯酸存在位置異構(gòu)現(xiàn)象，即C18∶1(9)為主要成分，含有極少量的C18∶1(11)。其中，十四烷酸相對(duì)含量為53.58%～62.52%，均值為58.73%，是相對(duì)含量最高的一類脂肪酸，這與文獻(xiàn)報(bào)道的66.79%相接近[6]；十八碳烯酸相對(duì)含量為15.04%～19.06%，均值為16.60%；十六烷酸相對(duì)含量為10.79%～14.07%，均值為12.08%。十四烷酸、十六烷酸和十八碳烯酸三者的相對(duì)含量占82.17%～91.11%，二十碳以下脂肪酸占了主要成分。飽和脂肪酸相對(duì)含量為69.34%～78.28%，均值為74.21%。飽和脂肪酸相對(duì)含量高，油脂化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可以作為工業(yè)用油。據(jù)報(bào)道，同屬植物肉豆蔻的十四烷酸相對(duì)含量為80%～90%[4-5]，而云南肉豆蔻不足70%，兩種的差異明顯。本研究中，采用30～60℃沸程和60～90℃沸程的兩種石油醚對(duì)第1號(hào)和第16號(hào)植株的種子分別提取種仁油，再進(jìn)行脂肪酸組成分析，結(jié)果表明兩種沸程的石油醚提取的種仁油，其含油率及脂肪酸組成和相對(duì)含量相同，說明以30～60℃沸程的石油醚就完全滿足云南肉豆蔻種仁油的提取。

據(jù)本課題組前期研究，琴葉風(fēng)吹楠種子油的十四烷酸平均含量為70.19%[10]，滇南風(fēng)吹楠的為47.21%，風(fēng)吹楠的為45.33%[11]，紅光樹的為54.74%，假廣子的為25.27%，小葉紅光樹的為24.09%[12-13]。如果僅從脂肪酸組成看，作為以十四烷酸為主的工業(yè)用油，云南肉豆蔻也不失為一個(gè)好的樹種。第13號(hào)植株的十四烷酸相對(duì)含量為62.25%，排名第2(第10號(hào)植株排名第1，含量為62.52%)。結(jié)合表1和表2數(shù)據(jù)，第13號(hào)植株種子發(fā)育飽滿，含油率最高，十四烷酸相對(duì)含量也最高，在本次參試植株中算得上優(yōu)良單株，但尚需進(jìn)一步觀察和測(cè)定，確認(rèn)其性狀是否具有良好穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

從云南省景洪市基諾鄉(xiāng)天然林中采集云南肉豆蔻22株樹的種子，其種長(zhǎng)群體變幅為34.73～45.89 mm，種寬為20.36～26.54 mm，單粒重為7.67～16.86 g；測(cè)定種仁含油率為6.37%～15.83%，依據(jù)相應(yīng)的出仁率計(jì)算出種子含油率為5.54%～14.83%；種仁油中共檢測(cè)到14種常見脂肪酸，分別為十二烷酸(C12∶0)、十三烷酸(C13∶0)、十四烷酸(C14∶0)、十五烷酸(C15∶0)、十六碳烯酸(C16∶1)、十六烷酸(C16∶0)、十七烷酸(C17∶0)、十八碳二烯酸(C18∶2)、十八碳烯酸(C18∶1)、十八烷酸(C18∶0)、二十碳烯酸(C20∶1)、二十烷酸(C20∶0)、二十二烷酸(C22∶0)、二十四烷酸(C24∶0)，其中十八碳烯酸存在位置異構(gòu)現(xiàn)象，即C18∶1(9)為主要成分，C18∶1(11)含量極少。十四烷酸相對(duì)含量53.58%～62.52%，均值為58.73%，是含量最高的脂肪酸。

云南肉豆蔻種子性狀在本居群內(nèi)單株間的變異并不豐富，綜合分析僅第13號(hào)植株種子發(fā)育飽滿，平均單粒重11.18 g，種仁含油率為15.83%，種子含油率為14.83%，含油率最高，十四烷酸相對(duì)含量為62.25%，比最高值(62.52%)僅低0.27個(gè)百分點(diǎn)，可以算是唯一的優(yōu)良單株，有必要進(jìn)一步觀察和測(cè)定。

致謝：感謝中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園馬宏老師協(xié)助采集種子，感謝中國科學(xué)院昆明植物研究所余珍高級(jí)工程師幫助分析脂肪酸組成，感謝云南省熱帶作物科學(xué)研究所農(nóng)產(chǎn)品加工實(shí)驗(yàn)室給予油脂提取的方便……