高效液相色譜法測(cè)定牛蒡子中牛蒡苷的含量

何 斌，張海靜，楊文海，付書林，陳夏冰，邵志勇，劉 武，童偉文，陶弼菲，陳 潔★

（1. 武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所， 430208；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院， 430070）

牛蒡子(Fructus Arctii)，始載于《名醫(yī)別錄》，原名惡實(shí)，別名鼠粘子、大力子、惡實(shí)，來(lái)源于菊科兩年生草本植物牛蒡?qū)倥］蚩?Arctium lappa L.)的干燥成熟果實(shí)，為常用中藥。民間應(yīng)用廣泛，藥理學(xué)證明有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、降血糖等作用。該中藥活性成分為木脂素類化合物，主要是牛蒡苷(Arctiin)和牛蒡苷元(Arctigenin，ACT)等。牛蒡苷在中藥牛蒡和毛頭牛蒡果實(shí)中含量較高，具有很高的新藥開發(fā)價(jià)值[1-3]。

牛蒡苷（Arctiin）是牛蒡子中的有效成分，具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗腫瘤、降血糖等多種藥理作用。具有疏散風(fēng)熱，宣肺透疹，利咽散結(jié)，解毒消腫之功效[4-6]。為更有效控制牛蒡子質(zhì)量，采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定牛蒡子中牛蒡子苷的含量，該法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可作為牛蒡子的質(zhì)量控制方法。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

美國(guó)Agi lent 1260型高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器，Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6mm，5μm)；牛蒡苷對(duì)照品，中國(guó)藥品生物制品檢定所，含量98%，批號(hào):110819-200404)；牛蒡子，購(gòu)于武漢強(qiáng)康藥業(yè)有限公司；甲醇、乙醇、乙腈為色譜純，德國(guó)默克公司生產(chǎn)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1色譜條件

色譜柱為Agi lent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm；流動(dòng)相為甲醇-乙腈-水（31:20:49，V:V:V）；流速為1.0mL/min；進(jìn)樣量為30μL；柱溫為(30±0.1)℃。

1.2.2樣品處理

取3個(gè)不同批次的牛蒡子各5g，分別研細(xì)，各取取粉末0.5g，精密稱定，置于50mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇40mL，密塞，超聲處理30min，放冷，搖勻，用干濾器濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液2mL，置25mL棕色量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，溶液經(jīng)孔徑0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

牛蒡苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備，精確稱取10mg牛蒡苷，溶于50mL棕色容量瓶中，甲醇定容，即得200μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。然 后 依 次 配 制 成 濃 度 為0.0、0.5、1.0、10.0、50.0、100.0、200.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)樣分析。分別以測(cè)得的峰面積(A)為橫坐標(biāo)，濃度(C)為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4方法學(xué)驗(yàn)證

取濃度分別為100.0、10.0、1.0μg/mL的牛蒡苷標(biāo)準(zhǔn)工作液，并進(jìn)行HPLC檢測(cè)，每個(gè)濃度1天內(nèi)設(shè)置5個(gè)平行，以考察日內(nèi)變異系數(shù)；重復(fù)檢測(cè)5d，以測(cè)定日間變異系數(shù)，將100.0、10.0、1.0μg/mL的牛蒡苷標(biāo)準(zhǔn)工作液加入已知牛蒡苷含量的牛蒡子粉中，進(jìn)行HPLC檢測(cè)，測(cè)定回收率。

2 結(jié)果

2.1色譜行為

在本試驗(yàn)所建立的方法下，牛蒡子苷保留時(shí)間為14min左右，藥物峰形對(duì)稱性良好，基線平穩(wěn)，藥峰與雜質(zhì)峰分離良好，無(wú)雜峰干擾。結(jié)果表明，本試驗(yàn)所建立的方法簡(jiǎn)便、快捷、穩(wěn)定，檢測(cè)效率高?？瞻咨V圖（圖1）、牛蒡苷元（1μg/mL）色譜（圖2）。

圖1 空白色譜圖

表3 牛蒡子中牛蒡苷含量測(cè)定結(jié)果

圖2牛蒡子苷（1μg /mL）色譜圖

2.2標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

牛蒡苷的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線見圖3。在本試驗(yàn)建立的方法下，牛蒡子苷標(biāo)準(zhǔn)品在0.5～200μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r=0.9999，線性方程為y=0.0237x(x表示牛蒡苷的峰面積；y表示牛蒡苷的濃度)。

圖3牛蒡苷的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

2.3方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

取濃度分別為100.0、10.0、1.0μg/mL的牛蒡子苷標(biāo)準(zhǔn)工作液，并進(jìn)行HPLC檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果為日內(nèi)變異系數(shù)在5%以內(nèi)；日間變異系數(shù)在10%以內(nèi)；牛蒡子苷的回收率分別為89.69%～96.33%之間；表明檢測(cè)方法準(zhǔn)確穩(wěn)定。具體回收率和變異系數(shù)見表1和表2。

表1日內(nèi)和日間回收率考察結(jié)果(n=5)

表2日內(nèi)和日間變異系數(shù)考察結(jié)果(n=5)

2.4樣品的測(cè)定

取3個(gè)不同批次的牛蒡子樣品(批號(hào):140201，140615，040916)各5g。研細(xì)、粉碎、甲醇定容、超聲、濾器、甲醇定容，溶液采用0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，制成供試品溶液，分別精密吸取5μL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算牛蒡苷含量，每批樣品測(cè)定5次，結(jié)果如表3。

3 討論與小結(jié)

3.1提取溶劑的選擇

根據(jù)牛蒡子苷的化學(xué)性質(zhì)和相關(guān)報(bào)道[7-9]，分別以甲醇、乙醇和二氯甲烷作為牛蒡苷的提取溶劑，并對(duì)牛蒡苷提取量進(jìn)行檢測(cè)比較。結(jié)果表明甲醇和乙醇的提取效率基本相同，但高于二氯甲烷的提取效率；考察甲醇和乙醇的回收率發(fā)現(xiàn)，甲醇提取后牛蒡苷的回收率相對(duì)較高，故選擇甲醇作為提取溶劑。

3.2流動(dòng)相的選擇及改進(jìn)

根據(jù)藥典相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，牛蒡苷的檢測(cè)多采用甲醇-水（1:1.1）為流動(dòng)相[10-11]，但在本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)牛蒡苷出峰時(shí)間較短，不能與雜質(zhì)分開，調(diào)節(jié)水相比例效果也不理想，且在試驗(yàn)過(guò)程中，甲醇-水混合的流動(dòng)相易產(chǎn)生氣泡，造成系統(tǒng)壓力和基線不穩(wěn)。因此改用乙腈-水為流動(dòng)相，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)色譜峰分離不理想，與雜質(zhì)不能良好分離。經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用甲醇-乙腈-水為流動(dòng)相后，相比相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，試驗(yàn)所建立的方法中色譜峰與雜質(zhì)峰得到良好分離，分離效果較好，出峰時(shí)間短，最終確定流動(dòng)相為甲醇-乙腈-水（31:20:49，V:V:V）。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)所建立的檢測(cè)方法，測(cè)得牛蒡子中牛蒡苷的含量為4.31%，該法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速，可作為牛蒡子的質(zhì)量控制方法。

[1]蔣淑敏.牛蒡化學(xué)成分和藥理作用的研究現(xiàn)狀.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2001，12(10)：941-942.

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