香蓮芪中藥制劑抗雞體內(nèi)大腸桿菌的試驗(yàn)研究

王王志志偉偉 王王志志剛剛 鄧鄧翠翠芬芬

（1 鄭州市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 鄭州 450052；2 河南省睢縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所河南睢縣476900；3 福建省寧德縣貝迪動(dòng)物藥品廠福建寧德352100）

香附輔以穿心蓮、黃芪，以中藥藥性理論為基礎(chǔ)，遵循“君臣佐使”配伍規(guī)律[1]組合而成香蓮芪組方。香附具有理氣解郁[2]和解熱鎮(zhèn)痛作用[3]，穿心蓮具有清熱、抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用[4]，黃芪具有利尿降壓、抗炎、強(qiáng)心及提高機(jī)體免疫[5]之功效，該組方對(duì)大腸桿菌有較好的抗菌活性[6]。用臨床分離鑒定的O2型大腸桿菌建立雞大腸桿菌病疾病模型，分別進(jìn)行預(yù)防試驗(yàn)和治療試驗(yàn)，旨在觀察香蓮芪中藥制劑的體內(nèi)抗菌活性，為該復(fù)方制劑的臨床應(yīng)用提供一些實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

香附(R hizom a cyperi)、穿心蓮(A ndrographis panniculata)和黃芪(A stragalus m em branaceus)；注射用乳酸環(huán)丙沙星，為山東某藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；0.5% 石碳酸、生理鹽水均由實(shí)驗(yàn)室配制。

1.1.2 菌種

O2型雞源性大腸桿菌，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所分離保存和鑒定。

1.1.3 培養(yǎng)基

EC 營(yíng)養(yǎng)肉湯，為山東某公司產(chǎn)品，批號(hào)：20140608；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，為山東某公司產(chǎn)品，批號(hào)：20140603；營(yíng)養(yǎng)瓊脂，為杭州某公司產(chǎn)品，批號(hào)20140616。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

健康1 日齡京白939 蛋公雛，由河南某經(jīng)營(yíng)公司種雞場(chǎng)提供。

1.1.5 儀器

D H G-9245A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，北京恒泰豐科試驗(yàn)設(shè)備有限公司；FA 1004N 電子天平，河南兄弟儀器設(shè)備有限公司；G H P-9270 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，深圳市愛(ài)特爾電子科技有限公司；SW -CJ-2F 型雙人雙面凈化工作臺(tái)，常州杰博森儀器有限公司；Y H-350Z 型全自動(dòng)不銹鋼雙層立式電熱蒸汽壓力消毒器，鎮(zhèn)江市科密儀器儀表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 中藥制劑的制備

按照方劑配伍組成準(zhǔn)確稱(chēng)取香附40g、穿心蓮20g 和黃芪30g，首次加10 倍蒸餾水浸泡lh 后，文火煎煮40m in，第2 次加8 倍量水，文火煎煮30m in，第3 次加6 倍量水，文火煎煮20m in,每次煎煮完后用8 層紗布過(guò)濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至1g生藥/m L 的濃度。121℃高壓滅菌15m in。4℃冰箱保存。

1.2.2 培養(yǎng)基的制備

按照培養(yǎng)基使用說(shuō)明配制，121℃高壓滅菌15 m in，液體培養(yǎng)基冷卻后，4℃冰箱保存?zhèn)溆?，固體培養(yǎng)基溫度降到55℃左右時(shí)澆平板。

1.2.3 菌懸液的配制

采用活菌計(jì)數(shù)法[7]，以獲得原菌液中細(xì)菌的個(gè)數(shù)為2×1012cfu/m L。

1.2.4 雞大腸桿菌病疾病模型的建立

隨機(jī)挑選30 只16 日齡雛雞，按0.8 m L/只雞腹腔注射2×108cfu/m L 菌液，觀察雞群癥狀及動(dòng)物死亡情況，篩選出最佳染菌濃度，以受試動(dòng)物感染細(xì)菌的最小致死量或80% 以上感染動(dòng)物出現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀作為最佳感染量[8]。經(jīng)臨床癥狀、病理剖檢、顯微觀察及劃線接種麥康凱瓊脂平板，菌落呈紅色[9-10]。即可初步診斷為雞大腸桿菌病。

1.2.5 預(yù)防試驗(yàn)

隨機(jī)選取16 日齡雛雞200 只，分成5 組，每組40 只，其中4 組按照1.2.4 的方法染菌，另外1 組不染菌。染菌的4 組分別口服1 m L 生理鹽水（對(duì)照組）、0.5 m L（低劑量組）、1 m L（中劑量組）和2 m L（高劑量組）的藥劑，連用10 d，1 次/天，再觀察2 周，觀察和記錄動(dòng)物的臨床表現(xiàn)、疾病發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸和消失情況。計(jì)算發(fā)病率、死亡率和保護(hù)率[8]。

發(fā)病率=發(fā)病動(dòng)物數(shù)/試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)×100%

死亡率=死亡動(dòng)物數(shù)/試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)×100%

保護(hù)率=未發(fā)病的動(dòng)物數(shù)/試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)×100%

1.2.6 治療試驗(yàn)

按照1.2.4 的方法染菌，待表現(xiàn)明顯癥狀時(shí)，隨機(jī)分成5 組，每組40 只，1 組皮下注射乳酸環(huán)丙沙星（按體重5 m g/kg）作為陽(yáng)性對(duì)照組；1 組口服1 m L 生理鹽水（陽(yáng)性對(duì)照組）；另外3 組分別口服香蓮芪中藥制劑1 m L（低劑量組）、2 m L（中劑量組）和4 m L（高劑量組），連用10 d，2 次/天，再觀察2 周，觀察和記錄動(dòng)物的臨床表現(xiàn)、疾病發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸和消失情況。計(jì)算死亡率、有效率和治愈率[8]。

有效率=癥狀好轉(zhuǎn)動(dòng)物數(shù)/發(fā)病動(dòng)物數(shù)×100%

治愈率=癥狀消失動(dòng)物數(shù)/發(fā)病動(dòng)物數(shù)×100%

1.2.7 試驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)

飼養(yǎng)管理按《蛋雞飼養(yǎng)技術(shù)手冊(cè)（第二版）》進(jìn)行。分層籠養(yǎng)，暖氣供熱，24 h 光照，自由采食和飲水。試驗(yàn)日糧為蛋雛雞配合飼料，由北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司提供。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用x±SD 表示，數(shù)據(jù)間差異的顯著性采用SPSS 13.0 軟件多重比較完成檢驗(yàn)，有極顯著性差異P＜0.01，有顯著性差異P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 香蓮芪中藥制劑可以降低人工感染雛雞大腸桿菌病的發(fā)病率

如表1 所示，試驗(yàn)雞于16 日齡腹腔注射大腸桿菌，同時(shí)口服1.0g/m L 香蓮芪中藥制劑的0.5m L、1.0 m L、2.0 m L 3 個(gè) 劑 量3d、10 d 及停藥2 周后，試驗(yàn)動(dòng)物的發(fā)病率在19 日齡時(shí)與感染對(duì)照組相比，給藥組均有極顯著差異(P＜0.01)，中、高劑量組與低劑量組之間也有極顯著的增強(qiáng)(P＜0.01)，由此提示，香蓮芪中藥制劑能夠顯著地預(yù)防人工感染大腸桿菌?。坏?6 日齡直至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，香蓮芪中藥制劑低、中、高劑量組均極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)，說(shuō)明口服香蓮芪中藥制劑，能明顯提高試驗(yàn)雞抵抗大腸桿菌的感染。而19 日齡時(shí)與中、高劑量組相比，差異不顯著(P＞0.05)，而與低劑量組差異均極顯著(P＜0.01)，建議臨床添加1.0m L 香蓮芪中藥制劑，可提高雛雞抗大腸桿菌病的能力。

2.2 香蓮芪中藥制劑對(duì)人工感染雛雞大腸桿菌病的保護(hù)率和死亡率

如表2 所示，口服香蓮芪中藥制劑后，可以調(diào)動(dòng)雛雞機(jī)體的防御體系，提高雛雞大腸桿菌病的保護(hù)率，降低其死亡率。香蓮芪中藥制劑中、高劑量對(duì)雞大腸桿菌病的保護(hù)率均超過(guò)85% ，死亡率低于5% ，與感染對(duì)照組有極顯著性差異（P＜0.01）。在保護(hù)率方面，中、高劑量組與低劑量組有極顯著性差異（P＜0.01）；在死亡率方面，中、高劑量組與低劑量組有顯著性差異（P＜0.05）；而中、高劑量組之間無(wú)顯著性差異。故建議臨床口服1.0 m L 香蓮芪中藥制劑，可提高雛雞抗病能力、降低死亡率。

表2 香蓮芪中藥制劑預(yù)防雞大腸桿菌病的保護(hù)率和死亡率（%）

2.3 香蓮芪中藥制劑治療人工感染雛雞大腸桿菌病的效果

如表3 所示，香蓮芪中藥制劑可以降低感染雛雞死亡率，與乳酸環(huán)丙沙星陽(yáng)性對(duì)照組有顯著性差異(P＜0.05)，極顯著低于感染對(duì)照組(P＜0.01)。其治愈率與陽(yáng)性對(duì)照組相比也有極顯著性差異(P＜0.01)，高劑量香蓮芪中藥制劑治療雞大腸桿菌病的有效率顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組(P＜0.05)。由此提示，香蓮芪中藥制劑能有效治療大腸桿菌急性感染，劑量效應(yīng)關(guān)系顯示，對(duì)發(fā)病期動(dòng)物可以適當(dāng)加大給藥頻率以達(dá)到較高的藥物濃度，進(jìn)而達(dá)到治愈疾病的目的。

3 討論

3.1 雛雞大腸桿菌病病理模型的建立

利用動(dòng)物疾病模型研究藥物抗病活性是目前常用的研究方法，然而疾病模型的建立與試驗(yàn)動(dòng)物種系、年齡、病原類(lèi)別、濃度、攻毒劑量和頻率等因素密切相關(guān)。

3.2 香蓮芪中藥制劑對(duì)人工感染雞大腸桿菌病的預(yù)防

給雛雞攻毒同時(shí)給予香蓮芪中藥制劑后，雖然香蓮芪中藥制劑不同劑量組均有試驗(yàn)動(dòng)物發(fā)病，甚至死亡，但發(fā)病率、死亡率均極顯著低于感染組(P＜0.01)。染菌前3 天，中、高劑量組保護(hù)率達(dá)到85% 以上，高于史書(shū)軍等報(bào)道[11-12]，且給藥組發(fā)病動(dòng)物僅在8～18 h 內(nèi)出現(xiàn)死亡，而隨著持續(xù)給藥，患病動(dòng)物的癥狀也逐漸好轉(zhuǎn)，最終全部恢復(fù)正常，使保護(hù)率可達(dá)到100% 。由此充分展示了藥物發(fā)揮作用需要時(shí)間，且香蓮芪中藥制劑既可以直接殺滅病原，又可以通過(guò)提高機(jī)體免疫力發(fā)揮抗病作用。通過(guò)對(duì)死亡動(dòng)物的剖檢發(fā)現(xiàn)，香蓮芪中藥制劑試驗(yàn)動(dòng)物肝臟有較輕微壞死灶，而感染組試驗(yàn)動(dòng)物肝臟出血、壞死明顯，說(shuō)明香蓮芪中藥制劑可能有一定毒性；香蓮芪中藥制劑死亡試驗(yàn)動(dòng)物腹腔內(nèi)積聚了大量的炎性細(xì)胞，脾臟器官指數(shù)顯著大于感染組，這表明香蓮芪中藥制劑能夠調(diào)動(dòng)機(jī)體免疫細(xì)胞，刺激脾淋巴細(xì)胞增殖，對(duì)抗大腸桿菌的入侵。

3.3 香蓮芪中藥制劑對(duì)人工感染雞大腸桿菌病的治療

對(duì)香蓮芪中藥制劑進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)其M IC 為0.25～1.0 g/m L，說(shuō)明香蓮芪中藥制劑體外抑制大腸桿菌的活性并不高，所以在香蓮芪中藥制劑連續(xù)給藥的前2 天內(nèi)，發(fā)病動(dòng)物死亡較多，隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，香蓮芪中藥制劑增強(qiáng)了動(dòng)物自體免疫防御系統(tǒng)，改善了動(dòng)物生理機(jī)能，進(jìn)而發(fā)揮抗病作用，中、高劑量組使病雞的死亡率控制在15% 以下，治愈率達(dá)到86.5% 以上，略高于王雙山等報(bào)道[13]；有效率達(dá)到93.8% 以上，與乳酸環(huán)丙沙星陽(yáng)性對(duì)照組有顯著性差異（P＜0.05 或P＜0.01），而在體外抑菌試驗(yàn)中乳酸環(huán)丙沙星顯示出明顯的抑菌效果。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，乳酸環(huán)丙沙星對(duì)人工感染雞大腸桿菌病的治療效果不如香蓮芪中藥制劑，這可能與香蓮芪中藥制劑能夠調(diào)動(dòng)雛雞機(jī)體免疫力有關(guān)。

[1]方向明，周美啟.“君臣佐使”的再思考[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2008，14(4)：258-259.

表3 香蓮芪中藥制劑對(duì)雞大腸桿菌病理模型的治療效果（%）

[2]周中流，劉永輝.香附提取物的抗抑郁活性及其作用機(jī)制研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（7）：191-193.

[3]歐潤(rùn)妹，鄧遠(yuǎn)輝，李偉英，等.香附不同溶劑提取物解熱鎮(zhèn)痛效應(yīng)的比較[J]. 山東中醫(yī)雜志，2004，23（12）：740-742.

[4]李春英，梁愛(ài)華，薛寶云，等.穿心蓮提取物的藥效學(xué)研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2009，15（10）：94-98.

[5]張樹(shù)森，盧恭信.論黃芪的藥用價(jià)值[J].海峽藥學(xué)，2001.l(4)124.

[6]賀常亮，韋旭斌，付本懂，等.治療雞大腸桿菌病的中藥方劑篩選[A].中國(guó)畜牧醫(yī)學(xué)會(huì)中獸醫(yī)分會(huì)2013年學(xué)術(shù)年會(huì)[C]，2013.353-361.

[7]徐淑云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1994.1208-1245.

[8]農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局.抗菌藥物Ⅱ、Ⅲ期臨床藥效評(píng)價(jià)試驗(yàn)指導(dǎo)原則[S].獸用化學(xué)藥物安全藥理學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)原則(中國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第1247 號(hào))，2009.161.

[9]姚火春.獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)(第二版)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2006.

[10]陳溥言.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2009.

[11]史書(shū)軍，趙興華，杜健.復(fù)方中草藥預(yù)防肉雞大腸桿 菌 病 的 研 究 [J]. 安 徽 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué)，2011，39(10)：5878,5900.

[12]張京和，關(guān)建民，曹金元，等.中草藥與抗生素預(yù)防肉雞大腸桿菌病的對(duì)比試驗(yàn)研究[J].當(dāng)代畜牧，2011，11：46-47.

[13]王雙山，歐陽(yáng)素貞，劉書(shū)梅，等.中草藥復(fù)方防治肉仔雞大腸桿菌病效果的研究[J].畜牧獸醫(yī)雜志，2008，27(1)：9-11.