版納微型豬近交系PPARD基因克隆及95G/A突變檢測(cè)*

陳園園，王 配△，霍金龍*，王淑燕，潘偉榮，施 晨，程 霞，曾養(yǎng)志，2

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省版納微型豬近交系重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

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科學(xué)研究

版納微型豬近交系PPARD基因克隆及95G/A突變檢測(cè)*

陳園園1,2，王 配1,2△，霍金龍1,2*，王淑燕1,2，潘偉榮1,2，施 晨1，程 霞1，曾養(yǎng)志1，2

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省版納微型豬近交系重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

為深入研究PPARD在豬體內(nèi)的調(diào)節(jié)和功能，以版納微型豬近交系(BMI)為試驗(yàn)動(dòng)物，通過RT-PCR方法擴(kuò)增得到PPARD基因全長(zhǎng)編碼區(qū)序列，在編碼區(qū)第95位檢測(cè)到A/G兩種核苷酸(GenBank登錄號(hào):KP757025、KP757026)。結(jié)果表明，該基因編碼462個(gè)氨基酸，蛋白分子量為49.74 kD，等電點(diǎn)為7.53。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析PPARD存在2個(gè)保守域，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，不存在信號(hào)肽，存在1個(gè)亮氨酸富集的核輸出信號(hào)，其N端、C端均親水；亞細(xì)胞定位顯示該蛋白分泌到細(xì)胞周質(zhì)的概率為69.6%。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明豬與牛、犬的親緣關(guān)系較近。利用qPCR檢測(cè)了PPARD基因mRNA在BMI 14個(gè)組織中的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在肝臟、耳朵、脾臟、小腸中表達(dá)量較高。

PPARD；基因克隆；熒光定量PCR；生物信息學(xué)分析

耳朵是動(dòng)物聽覺系統(tǒng)的重要部分，起著收集聲音的重要作用。然而不同的豬種耳朵大小不同，比如產(chǎn)于美國(guó)的杜洛克豬具有一副小且豎直的耳朵，而產(chǎn)于我國(guó)太湖地區(qū)的二花臉豬具有一副大且松軟的耳朵。Ren等[1]研究表明，PPARD(peroxisome proliferator activator receptor delta，過氧化物酶體增殖物激活受體δ)編碼區(qū)c. G95A是杜洛克豬和二花臉豬耳朵大小差異的主要QTL位點(diǎn)，PPARD基因第95位核苷酸G突變?yōu)锳，導(dǎo)致PPARD編碼蛋白的第32位氨基酸由甘氨酸(G，Gly)突變?yōu)楣劝彼?E, Glu)，杜洛克豬為c.95G對(duì)應(yīng)p.32Gly，而二花臉豬為c.95A對(duì)應(yīng)p.32Glu。PPARD是一個(gè)屬于核受體超家族的配體調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，在不同的生物重要過程中起著至關(guān)重要的作用。PPARD位于豬七號(hào)染色體，在脂肪代謝中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，它可以觸發(fā)脂肪的燃燒并且可以增強(qiáng)在脂肪組織及骨骼肌中的能源解偶聯(lián)，PPARD激活能增加肌肉中脂肪酸的攝取，它的活化加劇糖酵解和磷酸戊糖旁路的工作從而促進(jìn)脂肪酸的合成[2-8]，此外，PPARD在調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞和皮脂細(xì)胞分化中也扮演著重要角色[9]。

版納微型豬近交系(Banna Mini-pig Inbred Line, BMI)是利用全同胞和親子交配的高度近交方式，經(jīng)過嚴(yán)格選育培育成功的世界上首個(gè)大型哺乳動(dòng)物近交系，具有基因純合度高、遺傳背景清楚等優(yōu)點(diǎn)，可作為生物醫(yī)學(xué)試驗(yàn)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究、異種器官移植及動(dòng)物疾病模型建立的優(yōu)良試驗(yàn)動(dòng)物[10-12]，具有典型的豎直小耳朵特征。目前，尚未見對(duì)版納微型豬近交系的PPARD基因研究的報(bào)道。本研究使用RT-PCR方法擴(kuò)增并克隆BMIPPARD基因，測(cè)序檢測(cè)QTL位點(diǎn)并進(jìn)行一系列蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析，利用qPCR進(jìn)行多組織熒光定量表達(dá)分析，旨在為下一步以BMI為試驗(yàn)動(dòng)物模型研究PPARD在豬體內(nèi)的功能和調(diào)節(jié)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品和試劑

屠宰6頭18月齡的BMI，取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、皮膚、肌肉、耳朵、小腦、大腦、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸等14個(gè)重要組織，分別提取RNA。主要試劑RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、膠回收試劑盒以及克隆載體pMD18-T、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a等均購(gòu)自大連TaKaRa公司。

1.2 RNA提取

稱取大約100 mg的組織樣品，按照說明書步驟加入1 mL RNAiso Plus提取總RNA，用分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性。

1.3 cDNA的合成

將檢測(cè)合格的RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA，20 μL反轉(zhuǎn)錄體系：在0.2 mL的離心管中加入5 μg總RNA，1 μL 50 μmol/L的Oligo (dT)18，1 μL 10 mmol/L的dNTP mix，加RNase free dH2O到12 μL，輕微混勻，65 ℃加熱5 min，快速放入碎冰中冷卻，稍微離心；加入1 μL RNaseOUTTM(40 U/μL)，2 μL 0.1 mol/L DTT，4 μL 5×第一鏈合成緩沖液，混勻后37 ℃放置2 min；加入1 μL 200 U/μL的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，輕輕將其混勻，37 ℃溫育50 min，70 ℃加熱15 min終止反應(yīng)。將cDNA母液稀釋成25 ng/μL的工作液，進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.4 設(shè)計(jì)、合成PCR引物

根據(jù)NCBI上下載的豬PPARD序列AY188501，使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物，并利用Oligo 6軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)，F(xiàn)1/R1擴(kuò)增PPARD全長(zhǎng)編碼區(qū)。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，利用F2/R2進(jìn)行qPCR多組織熒光定量表達(dá)分析。引物信息見表1，引物均由上海生工有限公司合成。

表1 PPARD和GAPDH基因PCR引物

1.5 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系與程序

PCR反應(yīng)體系25 μL：17.75 μL的ddH2O，2.5 μL的Ex Taq Buffer，2 μL的dNTP，1.5 μL的耳組織cDNA，10 μM的上下游引物各0.5 μL，0.25 μL的Ex Taq酶，輕輕吹打混勻。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸10 min終止反應(yīng)。

1.6PPARD基因克隆

目的片段利用瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒回收純化，一部分純化產(chǎn)物直接送公司測(cè)序，另外一部分與pMD18-T載體連接進(jìn)行克隆測(cè)序，10 μL的連接反應(yīng)體系：1 μL的pMD18-T Vetor，4 μL的目的片段，5 μL的ligation mix。連接儀恒溫16 ℃條件下連接15 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于固體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)形成單菌落。白色陽(yáng)性單菌落于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h后提取質(zhì)粒，與純化的PCR產(chǎn)物一起送往上海生工有限公司進(jìn)行克隆后測(cè)序與純化PCR產(chǎn)物測(cè)序雙重鑒定。

1.7 qPCR多組織擴(kuò)增

以豬的各組織(心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、皮膚、肌肉、耳朵、小腦、大腦、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸)抽提的總RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用Eppendorf公司的熒光定量PCR儀(Mastercycler ep realplex4)，以F2/R2引物進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。擴(kuò)增體系20 μL：10 μL SYBR○RGreen I mix, 10 mmol/L上下游引物各0.8 μL，2 μL cDNA模板，6.4 μL ddH2O。擴(kuò)增參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性15 s；60 ℃退火15 s；72 ℃延伸30 s；加入溶解曲線，95 ℃運(yùn)行15 s，60 ℃運(yùn)行15 s，采集熒光20 min，95 ℃運(yùn)行15 s。

1.8 數(shù)據(jù)處理

對(duì)測(cè)序得到的結(jié)果利用DNAstar軟件進(jìn)行比對(duì)校正，得出PPARD編碼區(qū)序列，應(yīng)用Compute pI/Mw Tool程序預(yù)測(cè)氨基酸的分子量(Mw)及等電點(diǎn)(pI)，使用CDART工具預(yù)測(cè)蛋白保守結(jié)構(gòu)域，使用SOPMA程序預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)用TMHMM Server version 2.0程序預(yù)測(cè)，利用SignalP 4.1 server預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)信號(hào)肽，亮氨酸富集的核輸出信號(hào)使用NetNES1.1程序在線預(yù)測(cè)，利用Target 1.1 server程序預(yù)測(cè)蛋白亞細(xì)胞定位，使用ProtScale預(yù)測(cè)蛋白疏水結(jié)構(gòu)，使用DNAMAN、ClustalX及MEGA5等信息學(xué)軟件對(duì)多物種氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，并構(gòu)建多物種系統(tǒng)進(jìn)化樹[13]。qPCR結(jié)果使用2-△△ct法進(jìn)行處理，其中△△CT=(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)，計(jì)算PPARD在各組織中的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR擴(kuò)增的PPARD基因結(jié)果

從BMI耳組織中提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，以cDNA為模板，利用F1/R1引物擴(kuò)增PPARD基因得到1 586 bp長(zhǎng)片段，與預(yù)期結(jié)果一致(見圖1)。

圖1 RT-PCR擴(kuò)增的PPARD結(jié)果

2.2PPARD基因序列及對(duì)應(yīng)的氨基酸序列

膠回收的PCR產(chǎn)物原液與提取的陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行雙向測(cè)序后，得到的PPARD基因序列長(zhǎng)度為1 586 bp，序列已提交到GenBank并獲得核苷酸登錄號(hào)為“KP757025和KP757026”，該基因含有1 326 bp的開放閱讀框，編碼462個(gè)氨基酸。第95位核苷酸為G或者為A，生物信息學(xué)分析結(jié)果大體相一致，因此僅利用第95位核苷酸為G的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用Compute pI/Mw Tool預(yù)測(cè)到PPARD蛋白分子量為49.74 kD，等電點(diǎn)為7.53。利用Target 1.1 server程序預(yù)測(cè)到該蛋白分泌到細(xì)胞周質(zhì)的概率為69.6%。存在1個(gè)亮氨酸富集的核輸出信號(hào)(343 AA-350 AA)。圖2為BMIPPARD基因的核酸和對(duì)應(yīng)氨基酸序列，圖中標(biāo)識(shí)出了擴(kuò)增起始、終止密碼子信息、保守結(jié)構(gòu)域、亮氨酸富集的核輸出信號(hào)等。

2.3 PPARD蛋白的保守結(jié)構(gòu)域

利用NCBI網(wǎng)站的protein blast進(jìn)行PPARD基因的蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示有兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，其中73-156 AA屬于NR_DBD_PPAR結(jié)構(gòu)域，173-440 AA屬于NR_LBD_PPAR結(jié)構(gòu)域。

2.4 PPARD蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

PPARD蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白含28.12%的無(wú)規(guī)則卷曲，13.83%的β轉(zhuǎn)角，9.07%的延伸鏈結(jié)構(gòu)，48.98%的α螺旋。

圖2 PPARD基因編碼序列與翻譯的氨基酸序列

注：ATG是起始密碼子;*是終止密碼子;畫橫線的是預(yù)測(cè)的保守結(jié)構(gòu)域：73-156 AA(NR_DBD_PPAR)、173-440 AA(NR_LBD_PPAR);方框?yàn)楣δ躍NP位點(diǎn);陰影部分為亮氨酸富集的核輸出信號(hào)。

Notes: ATG is the initiation codon;*is the termination codon;The conserved domains are underlined: 73-156 AA (NR_DBD_PPAR), 173-440 AA (NR_LBD_PPAR);Functional SNP site is boxed;Leucine-rich nuclear export signals are shaded.

2.5 PPARD蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)

用Swiss-model程序?qū)PARD蛋白進(jìn)行同源建模，BMI PPAR delta的70-441 AA段與3e00.1.B的PPAR gamma蛋白相似性度為66.04%，預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)見圖3。

2.6 PPARD蛋白的亮氨酸富集的核輸出信號(hào)

使用NetNES1.1程序預(yù)測(cè)亮氨酸富集的核輸出信號(hào)，結(jié)果顯示BMI PPARD蛋白存在1個(gè)亮氨酸富集的核輸出信號(hào)(343 AA-350 AA)，見圖4。

圖3 PPARD的三級(jí)結(jié)構(gòu)

圖4 PPARD蛋白亮氨酸富集的核輸出信號(hào)

2.7 PPARD蛋白的疏水性

通過ProtScale程序來(lái)預(yù)測(cè)PPARD蛋白的疏水性，疏水性的大小由數(shù)值的大小表示。圖5顯示,PPARD蛋白在第354 AA處具有最大疏水值(3.333)，在第122 AA具有最小疏水值(-3.078)，蛋白N端與C端均親水(圖5)。

2.8 多物種PPARD的氨基酸序列比對(duì)

由圖6、圖7可知，根據(jù)BMIPPARD基因編碼

序列推導(dǎo)出的氨基酸序列，在NCBI網(wǎng)站BLAST后下載得到牛(NP_001077105)、犬(NP_001041567)、小鼠(NP_035275)、大鼠(NP_037273)和雞(NP_990059)等5個(gè)物種的PPARD基因?qū)?yīng)的氨基酸序列，使用MEGA5、DNAStar、DNAMAN、ClustalX等生物信息學(xué)軟件將豬PPARD的氨基酸序列與其進(jìn)行比對(duì)，相似性依次為95.7%、94.8%、90.5%、89.8%、85.5%。

圖5 PPARD蛋白質(zhì)的疏水結(jié)構(gòu)

注：預(yù)測(cè)數(shù)值小于0表示氨基酸親水，數(shù)值大于0表示氨基酸疏水

Fig. 5 Hydrophobicity structure of PPARD protein

Note: Negtive predicted figure mean hydrophilic, and positive redicted figures mean hydrophobic

圖6 豬的PPARD與其他5個(gè)物種PPARD氨基酸序列的相似性比對(duì)

注：上三角為相似度，下三角為分歧度。

Fig.6 Comparison of PPARD amino acid sequence similarity among pig and five other species

Notes:Upper triangular shows similarity; lower triangular shows divergence

2.9 多物種PPARD系統(tǒng)進(jìn)化樹

利用PPARD的氨基酸序列構(gòu)建了BMI、牛(NP_001077105)、犬(NP_001041567)、小鼠(NP_035275)、大鼠(NP_037273)和雞(NP_990059)等6個(gè)物種系統(tǒng)進(jìn)化樹，圖8顯示，BMI PPARD與牛和家犬的PPARD相似性最高，關(guān)系較近。

2.10 編碼區(qū)c. G95A SNP測(cè)序檢測(cè)

經(jīng)測(cè)序分析，BMIPPARD基因編碼區(qū)第95位核苷酸為c. G95A位點(diǎn)，測(cè)序結(jié)果見圖9。

圖7 豬的PPARD與其他5個(gè)物種PPARD蛋白的氨基酸多序列比對(duì)

圖8 多物種系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.11PPARD基因多組織定量檢測(cè)結(jié)果

以內(nèi)參基因GAPDH進(jìn)行校正，使用F2/R2引物定量分析PPARD基因在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、皮膚、肌肉、耳朵、小腦、大腦、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸等14個(gè)組織中的表達(dá)量，采用2-△△ct算法計(jì)算出不同組織的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明PPARD在豬的多個(gè)組織中均有表達(dá)，其中在肝臟、耳朵、脾臟、小腸中表達(dá)量較高，在其他組織中表達(dá)量較低，見圖10。

圖9 BMIPPARD編碼區(qū)第95位核苷酸位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果

Fig.9 Detection results of the 95th nucleotide site in BMIPPARDcoding region

圖10 PPARD基因14組織表達(dá)水平定量檢測(cè)結(jié)果

1.心臟；2.肝臟；3.脾臟；4.肺臟；5.腎臟；6.皮膚；7.肌肉；8.耳朵；9.小腦；10.大腦；11.十二指腸；12.空腸；13.回腸；14.結(jié)腸

Fig.10PPARDgene expression level in 14 tissues of BMI by qPCR method

1.Heart;2.Liver;3.Spleen;4.Lung;5.Kidney;6.Skin;7.Muscle;8.Ear;9.Cerebellum;10.Brain;11.Duodenum;12.Jejunum;13.Ileum;14.Colon

3 討 論

PPARD在哺乳動(dòng)物中具有多種功能，能調(diào)節(jié)脂肪的代謝，控制血脂、葡萄糖的穩(wěn)定[14]，與許多疾病的發(fā)生具有密切的關(guān)系。本研究克隆了PPARD基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)序列，該基因共編碼462個(gè)氨基酸，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，沒有信號(hào)肽，說明它是非分泌蛋白，不用經(jīng)過修飾可以直接釋放到細(xì)胞質(zhì)，構(gòu)成細(xì)胞本身，這也與亞細(xì)胞定位相一致。BMI PPARD存在1個(gè)亮氨酸富集的核輸出信號(hào)，該信號(hào)的主要功能在于蛋白亞細(xì)胞定位。

PPARD編碼區(qū)第95位核苷酸由G突變?yōu)锳，屬于一種錯(cuò)義突變，導(dǎo)致氨基酸由甘氨酸(G, Gly)變?yōu)楣劝彼?E, Glu)。杜洛克豬小且豎直的耳朵為c.95G對(duì)應(yīng)p.32 Gly，二花臉豬大且松軟的耳朵為c.95A對(duì)應(yīng)p.32 Glu[1]。BMI雖然表型為小且豎直的耳朵，但c. G95A均存在(圖9)，說明盡管BMI近交代數(shù)已很高，但該位點(diǎn)還沒有完全純合，也說明BMI小且豎直的耳朵表型不完全由PPARD決定，是否是由PPARD和其他基因協(xié)同作用的結(jié)果，還有待進(jìn)一步研究。

系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，BMI的PPARD與牛聚為一類，然后再與犬聚為一類，均為哺乳目，大鼠和小鼠為嚙齒目聚為一類，表明PPARD基因存在相對(duì)的種屬特異性，同源性越高，親緣關(guān)系越近。熒光定量PCR結(jié)果顯示，PPARD在14個(gè)組織中的表達(dá)量不同，在肝臟、耳朵、脾臟、小腸中表達(dá)量較高，肝臟與小腸在脂肪生成代謝中具有重要作用，說明PPARD在肝臟與小腸中發(fā)揮重要的生理作用，有研究發(fā)現(xiàn)，PPARD與結(jié)腸癌的發(fā)生有關(guān)[15]，在研究慢性腎臟疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)中也起重要作用[16]，結(jié)果表明PPARD在結(jié)腸與腎中均有表達(dá)。PPARD在不同組織中的差異表達(dá)現(xiàn)象有可能和該基因在不同的組織中所發(fā)揮的生理作用有關(guān)。

綜上所述，本研究成功克隆了BMIPPARD基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)序列，并進(jìn)行了功能預(yù)測(cè)，對(duì)編碼區(qū)的c. G95A位點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè)以及對(duì)該基因在多個(gè)組織中的表達(dá)量進(jìn)行了熒光定量檢測(cè)，將為更深入研究其在豬體內(nèi)的功能提供重要依據(jù)。

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中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜生態(tài)學(xué)分會(huì)2015年學(xué)術(shù)會(huì)議會(huì)訊

2015金昌論壇暨草食畜生產(chǎn)體系高效可持續(xù)性研討會(huì)，2015年家畜生態(tài)學(xué)分會(huì)八屆第三次常務(wù)理事會(huì)曁首屆家畜生態(tài)學(xué)科青年學(xué)者學(xué)術(shù)交流會(huì)分別于2015年8月19日至20日和8月21日至23日在甘肅省金昌市和寧夏回族自治區(qū)銀川市召開。

2015金昌論壇暨草食畜生產(chǎn)體系高效可持續(xù)性研討會(huì)主要關(guān)注現(xiàn)代草食畜生產(chǎn)體系可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)，同時(shí)就甘肅草食畜牧業(yè)發(fā)展的優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)進(jìn)行了探討，討論如何通過生產(chǎn)技術(shù)能力的提升，結(jié)合規(guī)?；B(yǎng)殖和市場(chǎng)化運(yùn)作，大力發(fā)展節(jié)糧型畜牧業(yè)的問題。來(lái)自美國(guó)、加拿大、澳大利亞、德國(guó)等國(guó)的草食畜牧業(yè)專家，國(guó)家絨毛用羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系、中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜生態(tài)學(xué)分會(huì)、國(guó)家肉牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系、草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、教育部草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等科研院所的專家參會(huì)并作學(xué)術(shù)報(bào)告，從生產(chǎn)體系建設(shè)、養(yǎng)殖技術(shù)、飼料利用、產(chǎn)品品質(zhì)提升、草地可持續(xù)利用等方面為草食畜牧業(yè)特別是我國(guó)西部草食畜牧業(yè)的提質(zhì)增效提供了大量有價(jià)值的技術(shù)經(jīng)驗(yàn)和對(duì)策建議。

2015年家畜生態(tài)學(xué)分會(huì)八屆第三次常務(wù)理事會(huì)曁首屆生態(tài)學(xué)科青年學(xué)者學(xué)術(shù)交流會(huì)以“區(qū)域可持續(xù)生態(tài)畜牧業(yè)發(fā)展”為主題。來(lái)自全國(guó)25個(gè)省(市)、自治區(qū)從事家畜生態(tài)學(xué)教學(xué)、科研、生產(chǎn)和管理的專家學(xué)者100余人圍繞主題，就農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)生態(tài)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展問題進(jìn)行了深入的探討和交流。期間共有29位專家及青年學(xué)者進(jìn)行專題報(bào)告，內(nèi)容涵蓋畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展、動(dòng)物和牧草遺傳資源評(píng)價(jià)與利用、動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與調(diào)控、健康養(yǎng)殖與動(dòng)物福利、畜牧場(chǎng)糞污及廢棄物處理等多個(gè)方面。此次會(huì)議得到了寧夏曉鳴農(nóng)牧股份有限公司大力支持與資助。

PPARDGene Cloning,95G/A Mutation Detection of Inbred Banna Minipigs

CHEN Yuan-yuan1,2△,WANG Pei1,2△, HUO Jin-long1,2*, WANG Shu-yan1,2, PAN Wei-rong1,2, SHI Chen1, CHENG Xia1, ZENG Yang-zhi1,2

(1.KeyLaboratoryofBannaMini-pigInbredLineofYunnanProvince,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China; 2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China)

PPARDgene plays an important role in animal metabolism. To study the regulation and function ofPPARDin pigs,PPARDcoding sequence was obtained by RT-PCR and submitted to GenBank with the access number KP757025 and KP757026. Two different nucleotides (A or G) at 95 nucleotide were obtained. Bioinformatics analysis showed that thePPARDgene encode a protein of 462 amino acids with a predicted molecular weight of 49.74 kD and the isoelectric point of 7.53. Protein structure analysis showed that PPARD protein contained two conserved domains and a leucine-rich nuclear export signal without transmembrane regions and signal sequence. Hydrophobicity analysis indicated that the N-terminus and C-terminus were hydrophilic. Subcellular localization analysis concluded that the the probability of secreting into periplasmic was 69.6%. Phylogenetic results discovered that the pigs had the closest relationship with cattle and dogs.PPARDmRNA expression in 14 tissues was tested by qPCR and the results showed that the expression level was high in liver, ear, spleen and small intestine. This study provided experimental basis for further study on the expression and regulation ofPPARDgene.

PPARD; gene clone; qPCR; bioinformatics analysis

2015-02-11

2015-04-03 [基金項(xiàng)目] 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160439，31460580)

陳園園(1990-)，男，山東東平人，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物分子遺傳學(xué)。E-mail:chenyuanyuan9030@163.com △并列第一作者。

*[通訊作者] 霍金龍(1975-)，男，山西五寨人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物分子方面的研究。 E-mail:jinlonghuo973@163.com

S811.6

A

1005-5228(2015)09-0013-07