辣椒素受體在大鼠坐骨神經(jīng)損傷再生過程中的作用研究*

張宏 齊超 錢貝 劉俊肖 張華 喬曉玲 李夏青

辣椒素受體（Capsaicin receptor）是一種可被辣椒素激活的非選擇性陽離子通道，屬于瞬時感受器電 位 通 道（transient receptor potential channels， TRP channels）家族，又稱為瞬時受體電位香草酸受體1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）。 由Aδ類和C類神經(jīng)纖維支配的組織幾乎都有TRPV1分布[1]，TRPV1可被辣椒素、熱刺激、低pH和源于多巴胺的內(nèi)源性脂質(zhì)激活，被認(rèn)為是有害物理、化學(xué)刺激信號的整合器，也稱之為傷害性感受器（noxious sensor）。目前認(rèn)為，TRPV1主要參與痛覺的傳導(dǎo)，與痛覺的產(chǎn)生和痛覺增敏密切相關(guān)。然而，也有文獻(xiàn)[2]報道TRPV1與CGRP、TrkA等與神經(jīng)再生有關(guān)的物質(zhì)存在密切關(guān)系。因此推測TRPV1有可能參與/干預(yù)神經(jīng)損傷與再生過程。為此本研究基于坐骨神經(jīng)壓榨性損傷的在體模型，在損傷前給予TRPV1阻斷劑以觀察TRPV1對坐骨神經(jīng)壓榨性損傷后再生過程的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物來源 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供SPF級SD大鼠24只，體重（190±10）g，許可證編號SCXK（軍）2007-004。

1.1.2 主要試劑和儀器來源 AMG-517（Selleck Chemicals，USA），微量注射器（上海注射器三廠提供），甲苯胺藍(lán)（北京化工廠提供），光學(xué)顯微鏡（Olympus，日本），戊二醛、鋨酸、二甲胂酸鈉由本校中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 雄性SD大鼠（180~200 g）24只，隨機(jī)分為單純損傷組和給予拮抗劑組（AMG517組），每組12只，每組均設(shè)1周、2周時間段。1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔麻醉。其中，給予拮抗劑組于損傷前1 h用微量注射器于右后肢足底皮下注射AMG517（300 μg/kg）[3]；單純損傷組于損傷前于右后肢足底皮下按同等標(biāo)準(zhǔn)注射生理鹽水。右后肢脫毛、消毒，股部行縱形切口切開皮膚約1.5 cm，延肌間隙分離筋膜、肌肉，暴露坐骨神經(jīng)，在距梨狀肌下緣5 mm處用止血鉗夾閉坐骨神經(jīng)60 s。逐層縫合后單獨(dú)飼養(yǎng)。

1.2.2 標(biāo)本的制備 在預(yù)計的觀察時間點(diǎn)麻醉動物，除去雙后肢被毛，行股后部縱形切口切開皮膚，分離筋膜、肌肉，充分暴露并游離坐骨神經(jīng)，從梨狀肌下緣至坐骨神經(jīng)分叉處將其剪下，右側(cè)再分別分為近、中、遠(yuǎn)約0.5 mm各三段，放入4%戊二醛中，4 ℃條件下放置3 h后，放入0.1 mol/L二甲胂酸鈉（pH=7.3）漂洗5次，1%鋨酸固定2 h，雙蒸水漂洗后梯度酒精脫水。環(huán)氧樹脂包埋。

1.2.3 半薄切片制作及甲苯胺藍(lán)染色 使用超薄切片機(jī)上分別對所取標(biāo)本連續(xù)切取8~10張1 μm橫切面（其中右側(cè)標(biāo)本均于靠近損傷部位切?。旁诘斡?滴蒸餾水的干凈載玻片上，酒精燈烘干，滴加1%甲苯胺藍(lán)染液，間斷加熱至染液微干，洗瓶沖洗掉多余染液，濾紙吸去多余水分，晾干后中性樹脂封片。

1.2.4 神經(jīng)纖維計數(shù) 染色后Olympus顯微鏡觀察，JVC顯微攝像儀攝取圖像。每個標(biāo)本選取6張橫切面記數(shù)神經(jīng)纖維數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用graph-pad prism 5.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計量資料以（±s）表示，比較采用ANOVA檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常坐骨神經(jīng)半薄切片特征 神經(jīng)纖維髓鞘密集，排列規(guī)則?？傮w特征見圖1。

2.2 坐骨神經(jīng)壓榨性損傷后神經(jīng)纖維數(shù)量變化 損傷近端與正常坐骨神經(jīng)相比，神經(jīng)纖維數(shù)量減少。損傷中心及損傷遠(yuǎn)端在損傷1周后可見大量髓鞘崩解產(chǎn)物和炎細(xì)胞浸潤，2周后可見施萬細(xì)胞（Schwann cell）包繞的新生有髓纖維。見圖2~4、表1。

2.3 損傷前給予AMG517對神經(jīng)軸突再生的影響損傷前給予AMG517，術(shù)后2周時，神經(jīng)纖維數(shù)目多于單純損傷組（P<0.01），且排列規(guī)則。術(shù)后1周時，損傷前是否給予AMG517對神經(jīng)纖維數(shù)目無明顯影響（P>0.05）。見圖2~4、表1。

圖1 健側(cè)坐骨神經(jīng)半薄切片甲苯胺藍(lán)染色（×1000）注：圖1A、1B為單純損傷組，圖1C、1D為給予拮抗劑再損傷組；圖1A、1C為術(shù)后1周，圖1B、1D為術(shù)后2周

表1 各組神經(jīng)纖維數(shù)目（x-±s） 個

圖2 坐骨神經(jīng)損傷近端半薄切片甲苯胺藍(lán)染色（×1000）注：2A、2B為單純損傷組，2C、2D為給予拮抗劑再損傷組；2A、2C為術(shù)后1周，2B、2D為術(shù)后2周；損傷近端損傷后2周神經(jīng)纖維數(shù)目與1周相比差異不明顯；相同時間點(diǎn)上，單純損傷組與給予拮抗劑組神經(jīng)神經(jīng)纖維數(shù)目差異不明顯

圖3 坐骨神經(jīng)損傷中心半薄切片甲苯胺藍(lán)染色（×1000）注：3A、3B為單純損傷組，3C、3D為給予拮抗劑再損傷組；3A、3C為術(shù)后1周，3B、3D為術(shù)后2周；術(shù)后1周時，損傷中心可見大量髓鞘崩解產(chǎn)物和炎細(xì)胞浸潤；術(shù)后2周時，給予拮抗劑組的神經(jīng)神經(jīng)纖維數(shù)目多于單純損傷組，且排列較為規(guī)則

圖4 坐骨神經(jīng)損傷遠(yuǎn)端半薄切片甲苯胺藍(lán)染色（×1000）注：4A、4B為單純損傷組，4C、4D為給予拮抗劑再損傷組；4A、4C為術(shù)后1周，4B、4D為術(shù)后2周；術(shù)后1周時，損傷遠(yuǎn)端可見大量髓鞘崩解產(chǎn)物和炎細(xì)胞浸潤；術(shù)后2周時，給予拮抗劑組的神經(jīng)神經(jīng)纖維數(shù)目多于單純損傷組，且排列較為規(guī)則

由表1可以得出，健側(cè)、損傷近端各組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；損傷中段：單純損傷組1周與2周、AMG517組1周與2周、單純損傷2周與AMG517組2周，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），后者神經(jīng)纖維數(shù)目多于前者，其余組別間無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）；損傷遠(yuǎn)端：單純損傷組1周與2周、AMG517組1周與2周、單純損傷組2周與AMG517組2周，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），后者神經(jīng)纖維數(shù)目多于前者，其余組別間無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。

3 討論

辣椒素受體（TRPV1）屬于TRP通道家族，是TRPV子族的首位成員，也是哺乳動物6種熱敏通道之一。它有6個跨膜區(qū)，其中在第5和第6個跨膜區(qū)之間有一個短的孔狀疏水結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)參與并調(diào)控了辣椒素激活 VR1 的過程。其氨基末端的親水區(qū)（432個氨基酸）包含了一個脯氨酸富集區(qū)，其連接了3個鉤狀重復(fù)區(qū)域，據(jù)推測可能參與了受體蛋白之間的相互作用；羧基末端（154個氨基酸）包含了一些不可識別的基序[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，由Aδ類和C類神經(jīng)纖維支配的組織，幾乎都有TRPV1分布，包括神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)和泌尿等系統(tǒng)。如腦內(nèi)的大腦皮質(zhì)、下丘腦和背側(cè)丘、小腦皮質(zhì)、紋狀體、嗅核、中腦、嗅球、腦橋、藍(lán)斑、海馬和導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)等腦區(qū)，以及脊髓和感覺神經(jīng)節(jié)（背根神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)節(jié)）都有表達(dá)[5]。除辣椒素外，TRPV1還可被熱刺激（≥43 ℃）以及多種化學(xué)物激活，包括內(nèi)源性大麻素、大麻素、外用止痛藥、崁酮、胡椒堿、蒜素。有害性化學(xué)物質(zhì)或熱刺激引起的TRPV1介導(dǎo)的陽離子流，會因?yàn)榈蚿H值而得到加強(qiáng)。實(shí)際上，與損傷相關(guān)的組織酸中毒（pH≤5.9）這一特征性狀態(tài)，會引起TRPV1熱活化閾值的改變，所以TRPV1才會在室溫狀態(tài)下被激活。TRPV1活化閾值的改變和辣椒素介導(dǎo)的反應(yīng)的增強(qiáng)也可由酒精、尼古丁、炎癥細(xì)胞因子引起。此外，緩激肽、神經(jīng)生生長因子等一些促進(jìn)痛覺形成的物質(zhì)，可以活化磷脂酶C，繼而引起的PIP2水平下降以及PKC介導(dǎo)的對TRPV1受體的磷酸化作用，兩者均可使TRPV1的活性增強(qiáng)。所以，TRPV1是一個多種信號的整合器，可以轉(zhuǎn)換由多種傷害性刺激誘發(fā)產(chǎn)生的信號[6]。一些TRPV通道的功能受到嵌入或停留在漿膜的調(diào)節(jié)。TRPV1與神經(jīng)胞吐蛋白（SNARE）依賴的胞吐途徑中的一些成分相互作用，這些相互作用可以促進(jìn)PKC介導(dǎo)的TRPV1向胞膜的遷移。而且，促痛因子如神經(jīng)生長因子可通過酪氨酸激酶介導(dǎo)的對TRPV1的酪氨酸磷酸化作用促進(jìn)TRPV1向胞膜表面的嵌入[7]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，TRPV1與突觸前、突觸后蛋白質(zhì)共存于脊髓皮質(zhì)神經(jīng)元中，并能影響脊髓形態(tài)。而且，TRPV1存在于內(nèi)生的突觸小體里。在背根神經(jīng)節(jié)來源的一種細(xì)胞系里，TRPV1富集于細(xì)長的絲狀偽足以及細(xì)胞接觸部位。而且在突觸的轉(zhuǎn)運(yùn)小體、絲狀偽足的傳輸小泡中、神經(jīng)突中也檢測到TRPV1。TRPV1的激活可快速調(diào)節(jié)這些囊泡的循環(huán)和融合，使得絲狀偽足結(jié)構(gòu)得到快速重組。說明TRPV1參與了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成、突觸調(diào)節(jié)、神經(jīng)遞質(zhì)釋放等過程[8]。而且TRPV1跟降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）、神經(jīng)營養(yǎng)因子受體（TrkA）等與神經(jīng)再生有關(guān)的物質(zhì)存在密切關(guān)系。因此推測TRPV1可能參與了神經(jīng)再生。已經(jīng)證實(shí)CGRP與感覺信息，特別是傷害性刺激信息的傳入與整合關(guān)系密切、是參與疼痛信號傳導(dǎo)的主要分子之一，且實(shí)驗(yàn)也已證實(shí)CGRP與TRPV1免疫共定位于Aδ與C纖維的感覺神經(jīng)細(xì)胞[2]。近10多年CGRP在神經(jīng)損傷及再生過程中的作用受到了廣泛重視。周圍神經(jīng)壓榨損傷后，殘留的未損傷神經(jīng)纖維及相應(yīng)背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（Dorsal root ganglia， DRG）CGRP的表達(dá)上調(diào)[9]，這種上調(diào)提示CGRP可能參與了早期向中樞傳遞損傷信號并可能參與激活或誘導(dǎo)神經(jīng)再生的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。表達(dá)CGRP的DRG神經(jīng)元中有84%同時可以表達(dá)TrkA；大多數(shù)CGRP免疫熒光陽性神經(jīng)元也同時為TRPV1陽性[10]。全身應(yīng)用辣椒素可使感覺神經(jīng)元CGRP大量釋放而耗竭同時伴有TrkA表達(dá)下降，這種現(xiàn)象可通過給予NGF后逆轉(zhuǎn)[11]。有人提出TRPV1激活所引起的鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶/cAMP反應(yīng)元素結(jié)合蛋白（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases Ⅱ/cAMP responsive element binding protein，CaMK Ⅱ/CREB）磷酸化的增加是導(dǎo)致感覺神經(jīng)元CGRP合成增加的機(jī)制之一[12]。而NGF通過其受體-TrkA促神經(jīng)元存活及神經(jīng)突起再生的信號機(jī)制目前認(rèn)為主要與有絲分裂原激活的蛋白激酶（The mitogen-activated protein kinases，MAPKs） 信號通路蛋白ERK1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2）及 JNLs（c-Jun N-terminal kinases）的磷酸化增強(qiáng)有關(guān)[13]；也有人認(rèn)為非鈣依賴性磷酸肌醇酯-激酶（3phosphoinositide-3 kinase，PI3K）及其相關(guān)下游信號通路蛋白（Akt/PKB）的激活也是神經(jīng)營養(yǎng)因子促使神經(jīng)再生及分支的機(jī)制之一[14]。

辣椒素受體作為一種多型信號探測器及多種疼痛感受器，雖然上世紀(jì)末才被成功克隆，卻因其生物學(xué)特點(diǎn)，成為現(xiàn)今最受關(guān)注、得到研究最為廣泛的非選擇性陽離子通道之一，以其為靶點(diǎn)的臨床藥物研究也同樣開展廣泛[15]。本實(shí)驗(yàn)采用坐骨神經(jīng)壓榨性損傷在體模型，觀察使用或不使用TRPV1拮抗劑阻斷該受體前提下，受損神經(jīng)的不同修復(fù)情況，以探討其對神經(jīng)損傷后再生的影響。本實(shí)驗(yàn)表明，在阻斷TRPV1的條件下，再生有髓神經(jīng)纖維數(shù)目多，排列規(guī)則。可見阻斷TRPV1有利于大鼠坐骨神經(jīng)壓榨性損傷后的修復(fù)。

可以提出以下設(shè)想：神經(jīng)損傷局部由于各種傷害性物質(zhì)的產(chǎn)生可導(dǎo)致TRPV1體激活；激活的TRPV1可通過與TrkA相似的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制MEK/MAPK-ERK或PI3K/Akt（PKB）等影響包括CGRP在內(nèi)的與軸突再生有關(guān)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)合成及表達(dá)增加，以此參與神經(jīng)再生過程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，作為新一代鎮(zhèn)痛藥物的TRPV1拮抗劑，是否有可能在臨床應(yīng)用中作為有利于神經(jīng)損傷后修復(fù)的藥物來使用。

[1] LUO Xiu-ju， PENG Jun， LI Yuan-jian.Recent advancesin the study on capsaicinoids and capsinoids[J].Eur J Pharmacol， 2011， 650（1）：1-7.

[2] Horie S，Michael G J，Priestley J V.Co-localization of TRPV1-expressing nerve fibers with calcitonin-gene-related peptide and substance P in fundus of Rat Stomach[J].Inflammopharmacology，2005，13（1-3）：127-137.

[3] Wanner S P， Garami A， Pakai E， et al.Aging reverses the role of the transient receptor potential vanilloid-1 channel in systemic inflammation from anti-inflammatory to proinflammatory[J].Cell Cycle，2012，11（2）：343-349.

[4]駱昊，萬有，韓濟(jì)生.辣椒素及其受體[J].生理學(xué)進(jìn)展，2003，34（1）：11-15.

[5] ALAWI K， KEEBLE J.The paradoxical role of the transient receptor potential vanilloid 1 receptor in inflammation[J].Pharmacol Ther，2010，125（2）：181-195.

[6] Venkatachalam K， Montell C.TRP channals[J].Annu Rev Biochem，2007，76（1）：387-417.

[7] Morenilla-Palao C， Planells-Cases R， Garcia-Sanz N，et al.TRV1 involvement in inflammatory pain：mechanisms and pharmacological modulation[J].Journal of Neurochemistry ，2003，85（2）：65-72.

[8] Goswami C，Rademacher N， Smalla K H.TRPV1 acts as a synaptic protein and regulates vesicle recycling[J].J Cell Sci，2010，123（12）：2045-2057.

[9] Li X Q， Verge V M K，Johnsion J M，et al.CGRP peptide and regenerating sensory axons[J].J Neuropathol Experi Neurol，2004，63（10）：1092-1103.

[10] Aoki Y， Ohtori S， Takahashi K， et al.Expression and CoEexpression of VR1，CGRP，and IB4binding glycoprotein in dorsal root ganglion neurons in rats：differences between the disc afferents and the cutaneous afferents[J].Spine，2005，30（13）：1496-1500.

[11] Ruiz G，Banos J E.The effect of endoneurial nerve growth factor on calcitonin gene-related peptide expression in primary sensory neurons[J].Brain Res， 2005，1042（1）：44-52.

[12] Nakanishi M，Hata K，Nagayama T.Acid activation of TRPV1 leads to an up-regulation of calcitonin gene-related peptide expression in dosal root ganglion neurons via the CaMK-CREB cascade：a potential mechanism of inflammatory pain[J].Mol Bio Cell，2010，21（15）：1568-2577.

[13] Waetzig V， Loose K， Haeusgen W， et al.c-Jun N- terminal kinases mediate Fas-induced neurite regeneration in PC12 cells[J].Biochem Phamacol，2008，76（11）：1476-1484.

[14] Gallo G， Letourneau P C.Localized sources of neurotrophins initiate axon collateral sprouting[J].J Neurosci，1998，18（14）：5403-5414.

[15]李魁君，李春剛，劉興君.辣椒素受體（TRPV1）的生物學(xué)作用及其作為藥物靶點(diǎn)的研究進(jìn)展[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2011，28（11）：917-927.