冠脈顯色指導(dǎo)下冠脈結(jié)扎法在制作大鼠心肌梗死模型中的應(yīng)用*

許云俊 李興岳 盧新林 梁偉鈞

大鼠是常用來制作急性心肌梗死的模型動物。造模的方法多采用冠脈結(jié)扎法，部位為左冠狀動脈前降支近段。大鼠模型心肌梗死面積大小差異也十分顯著。Tucci[1]報道雄性成年大鼠的心梗造模存活率為56%、雌性成年大鼠存活率為83%，雄性成年大鼠建立心梗模型后，心肌經(jīng)TTZ染色后測量心梗面積，得出其面積（40±19）%，變異系數(shù)（CV）=47%，跨越了大面積心肌梗死的界限值40%。65%存活的大鼠心肌梗死面積在45%以上，有1/3大鼠心梗面積低于40%，其后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)大面積心肌梗死與非大面積心肌梗死在血流動力學(xué)上有著顯著的差異。Luciano等[2]測得大鼠心梗面積為（21.7±22.0）%，CV=101%；Zornoff等[3]報道心梗面積為4%~65%；國內(nèi)高琴等[4]研究得出大鼠術(shù)后6周的存活率為52.5%，心梗面積占左心室的（42±13）%，CV=31%；雷敬輝等[5]研究結(jié)論為術(shù)后4周的存活率為75%，心梗面積占左心室的（41±13）%，CV=32%。可見，急性心肌梗死模型建立后心肌梗死面積并不穩(wěn)定，將導(dǎo)致后續(xù)實驗結(jié)果數(shù)據(jù)的偏倚。心梗面積變異大的重要原因可能是左冠狀動脈前降支走行的解剖變異，導(dǎo)致被結(jié)扎的冠狀動脈供血區(qū)域大小不一。本研究從左冠狀動脈解剖走行入手，試圖找出結(jié)扎后心梗面積變異大的原因，并尋找一個理想的結(jié)扎點，減少結(jié)扎后心梗面積的變異。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及方法 12~14周齡雄性SD大鼠170只，體重320~380 g，由廣東省實驗動物中心提供[許可證號：SCXK（粵）2013-0002]，飼養(yǎng)條件：室溫（20±2）℃，相對濕度（60±10）%，室內(nèi)保持12 h明/12 h暗晝夜交替；G-10瓊脂糖（GENE美國）；珠江牌藍墨水。

1.2 方法

1.2.1 瓊脂糖凝膠的配制 分別將瓊脂糖0.5、1、1.5、2 g用雙蒸水定容至50 mL，加入藍墨水3 mL，加熱煮沸，冷卻至37 ℃保溫備用，即為1%、2%、3%、4%液態(tài)瓊脂糖凝膠。

1.2.2 大鼠離體心臟主動脈插管 大鼠頸椎脫臼處死后，開胸取出心臟，注意保留足夠長升主動脈，插入直徑為1.5 mm的PVC管至主動脈根部，20 mL肝素鹽水沖洗冠脈后備用。SD大鼠8只分別用37 ℃ 1%、2%、3%、4% 4種不同濃度的瓊脂糖凝膠行主動脈灌注，每組兩只，觀察其顯色效果。2% 37℃瓊脂糖凝膠主動脈灌注，壓力為80 mm Hg，持續(xù)至冠脈遠端充盈良好，保持灌注壓力下立即置入室溫生理鹽水中冷卻，濾紙吸干心臟表面水，數(shù)碼相機拍照，多角度成像。

1.2.3 左冠脈結(jié)扎點的確定 選取101只大鼠不同心臟照片中相同角度的圖片，使用ACDsee Pro 2.5及Office 2010軟件處理，沿心緣剪切圖片，使得每張圖片尺寸相同，標記左心耳下緣至心尖中1/3區(qū)域供應(yīng)左室游離壁及心尖的冠脈，將101張圖片中的標記線疊合，可見線條最密集區(qū)域有兩處，高位結(jié)扎點位于肺動脈圓錐左緣與左心耳下緣交點，低位結(jié)扎點位于左心耳下緣至心尖連線的中點的前室間溝左側(cè)8~10 mm。

1.2.4 急性心肌梗死模型的制作 將60只SD大鼠按體重、窩別、周齡等因素均衡后隨機分為兩組。用1%戊巴比妥鈉按45 mg/kg行腹腔注射進行麻醉，并同時腹腔注射青霉素10萬單位，前胸備皮后仰臥固定，小動物呼吸機（泰盟科技有限公司 成都）接面罩行持續(xù)正壓無創(chuàng)通氣，氣道壓力8~12 cm H2O，消毒鋪巾，按照Olivetti G法[6]，左側(cè)胸第4、5肋間隙切口開胸，逐層鈍性分離胸壁，不剪斷肋骨進入胸腔，剝離心包及脂肪組織，暴露心臟，于高位結(jié)扎點結(jié)扎大鼠左冠狀動脈的前降支30例，低位結(jié)扎點結(jié)扎左冠狀動脈左室支30例。結(jié)扎深度1 mm，寬度2~3 mm。觀察左室游離壁及心尖的顏色、室壁運動變化。成功后，關(guān)閉胸腔，胸腔抽負壓后，拔除胸腔引流管，呼吸機脫機，保溫至麻醉清醒后單籠飼養(yǎng)。

1.2.5 N-BT染色測定心肌梗死面積 參照文獻[7]，術(shù)后第4天，頸椎脫臼法處死大鼠，取出心臟，用生理鹽水沖洗干凈心腔內(nèi)積血，去除心房組織、右心室游離壁及脂肪組織后稱重；將左心室平行左室橫斷面切成6~8片，浸入氯化硝基四氮唑藍（NBT）磷酸緩沖液中，置37 ℃恒溫水浴30 min，待染色完全后取出，正常心肌染成藍色，缺血心肌或壞死心肌不染色。切下缺血心肌稱重，用缺血心肌與左心室濕重百分比計算心肌梗死面積。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料以率表示，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同溶度瓊脂糖凝膠行主動脈灌注效果的比較 1%瓊脂糖凝膠主動脈灌注后，冠脈著色的同時心肌也被染色，冠脈與背景不能形成鮮明的對比，冠脈顯色模糊（圖1a）；2%瓊脂糖凝膠主動脈灌注后，冠脈著色而心肌不被染色，冠脈與背景形成鮮明的對比，冠脈顯色清晰（圖1b）；3%、4%瓊脂糖凝膠主動脈灌注后，瓊脂糖凝膠不能充盈冠脈遠端，冠脈遠端不能顯示（圖1c、圖1d）。具體見圖1。

圖1 不同溶度瓊脂糖凝膠行主動脈灌注效果

2.2 左冠狀動脈及分支走行情況 采用2%瓊脂糖凝膠行主動脈灌注后，可見冠脈走行分為4種類型。類型a：左冠狀動脈主干從左心耳后方發(fā)出后即分為前降支和回旋支，前降支延續(xù)為左室支（圖2a）；類型b：左主干發(fā)出后直接延續(xù)為左室支至心尖（圖2b）；類型c：左主干延續(xù)為前降支后分為3~5支供應(yīng)左室游離壁及心尖（圖2c）；類型d：左主干延續(xù)為前降支后沿前室間溝走行，沿途垂直發(fā)出3~5個分支（圖2d）。具體見圖2及表1。

表1 101只大鼠冠脈走行4種類型所占比例

2.3 N-BT法檢測大鼠心肌梗死面積 大鼠心肌梗死模型術(shù)后第4天，處死大鼠，取出心臟，行N-BT染色。具體見圖3。

圖2 左冠狀動脈及分支走行情況

圖3 N-BT法檢測大鼠心肌梗死面積

2.4 高位結(jié)扎與低位結(jié)扎存活率、梗死面積的比較 高位結(jié)扎30例大鼠，死亡13例；11例結(jié)扎后數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)的室顫，立即捏閉術(shù)口行胸外心臟按壓，3例存活，8例死亡；3例為術(shù)中損傷肺動脈圓錐出現(xiàn)大出血，1例麻醉過深，過早撤離呼吸機，呼吸衰竭死亡。低位結(jié)扎30例，死亡4例，2例麻醉過深，過早撤離呼吸機，呼吸衰竭死亡，1例出現(xiàn)室顫，1例術(shù)后第2天死亡，死因不明。所有大鼠均為無創(chuàng)通氣輔助呼吸，術(shù)中未出現(xiàn)呼吸機輔助呼吸相關(guān)的不良事件。高位結(jié)扎制作的心梗模型組梗死面積大于低位結(jié)扎組（P<0.01）。高位結(jié)扎組及低位結(jié)扎組心肌梗死面積的變異系數(shù)均小于文獻報道中的各值，該方法結(jié)扎的穩(wěn)定性較好。見表2。

3 討論

急性心肌梗死是臨床上常見病與多發(fā)病。實驗性心肌梗死動物模型的制備是研究缺血性心臟病發(fā)病與治療機理的重要手段與工具。楊永輝等[8]利用新西蘭兔建立急性心肌梗死的簡易模型，但存在費用高，冠脈側(cè)枝循環(huán)多等不利情況，不能廣泛應(yīng)用于實驗，而大鼠具有優(yōu)勢。建立模型的方法多種多樣，由于結(jié)扎冠脈所形成的心肌梗死或心肌缺血最接近急性心肌梗死的病理及病理生理過程，因此造模多選擇冠脈結(jié)扎法。但是該模型制作方法存在需要氣管插管或氣管切開下呼吸機支持、造模后動物存活率低、心肌梗死面積大小不一等問題。盧新林等[9]采用面罩接呼吸機無創(chuàng)通氣行呼吸支持能減少實驗動物的死亡率，本研究亦采用該方法。為解決結(jié)扎冠狀動脈制作在體大鼠心梗模型存在的問題，需要尋找導(dǎo)致問題的根源。由于大鼠冠狀動脈位于心外膜下，動脈血液充盈下肉眼下無法與其同樣呈鮮紅色的背景心肌組織辨認出來。能較易看到的是靜脈，因其呈暗紅色，可與背景心肌組織區(qū)別開來。因此，結(jié)扎冠狀動脈就存在盲目性，這是以往造模失敗的主要原因[10]。Degabriele等[11]研究顯示建模的成功率，心功能及梗死程度主要取決于結(jié)扎的部位。在心梗模型建立過程中，冠脈結(jié)扎位置的選擇上報道存在差異，Miyahara等[12]選擇距離肺動脈圓錐與左房交界（冠脈起始處）的遠端2~3 mm處結(jié)扎；而Vakeva等[13]選擇在冠脈起始處遠端3~4 mm結(jié)扎。國內(nèi)的文獻報道亦是眾說紛紜。到底在哪結(jié)扎，取決于左側(cè)冠狀動脈的解剖位置。因此，能在新鮮的心臟標本上顯示出冠脈的走行尤為重要。

表2 高位結(jié)扎與低位結(jié)扎結(jié)果在存活率、梗死面積的對比

本研究利用2%瓊脂糖凝膠的特性，高溫下呈液態(tài)，從主動脈根部灌注時能充盈冠脈系統(tǒng)，冷卻至室溫時呈固態(tài)，加入藍墨水后能很好的與背景心肌的鮮紅色形成對比，從而能清楚地顯示出冠脈的走行。1%的瓊脂糖灌注時由于其黏度較低，迅速將心肌染色藍色，不利于作為背景與冠脈的藍色對比。3%以上的瓊脂糖凝膠粘度過高，不能較好的充盈冠狀動脈的遠端，不能顯示出整個冠脈系統(tǒng)。101只大鼠心臟標本均通過該方法清楚地顯示出冠脈的走行情況。可見左側(cè)冠脈的走行有4種類型，解剖變異非常大。姜宗來等[14]研究大鼠冠脈鑄型亦得出類似結(jié)果，因此結(jié)扎后心梗面積大小不一與之密切相關(guān)。如何能消除解剖變異導(dǎo)致的結(jié)扎后心梗面積不穩(wěn)定，需要找到一個或多個結(jié)扎點，使得各種類型的大鼠左冠狀動脈同一節(jié)段都通過改點。用圖像疊合的方法可以看出大鼠左冠狀動脈有兩個點重疊最顯著。其一為高位結(jié)扎點，即為左心耳根部與肺動脈圓錐左緣的交點；其二為低位結(jié)扎點，左心耳下緣至心尖連線的中點的前室間溝左側(cè)8~10 mm。本研究從兩個結(jié)扎點各造模30例，可見高位結(jié)扎點能建立大面積心肌梗死模型，N-BT染色測量心梗面積為42.9%~53.5%，標準差為5.3；低位結(jié)扎點結(jié)扎亦能穩(wěn)定的心梗模型，心梗面積為29.8%~39.6%，標準差為4.9。高位結(jié)扎雖能獲得更大面積的心梗模型，但由于梗死面積過大，易導(dǎo)致術(shù)中室顫，且結(jié)扎點離肺動脈圓錐近，該處心肌組織菲薄，可能至右室流出道穿孔，大大降低大鼠心梗模型的存活率；相反，結(jié)扎低位結(jié)扎點由于梗死心肌有限，不易發(fā)生室顫，且此處為左室壁，心肌厚，不易出血，亦能較好的滿足實驗的需要。

綜上所述，大鼠左側(cè)冠狀動脈解剖變異是心梗模型的心梗面積大小不一的重要原因，高位結(jié)扎與低位結(jié)扎均能獲得心梗面積穩(wěn)定的大鼠模型。但本研究未進一步從血流動力學(xué)、心室重構(gòu)、心臟功能等方面研究高位結(jié)扎與低位結(jié)扎是否存在顯著差異，需要進一步研究。冠脈顯色指導(dǎo)下冠脈結(jié)扎法在制作大鼠心肌梗死模型值得推廣。

[1] Tucci P J.Pathophysiological characteristics of the post-myocardial infarction heart failure model in rats[J].Arq Bras Cardiol，2011，96（8）：420-424.

[2] Luciano F L， Jorge M， Eduardo E V，et al.Myocardial infarction area quantification using high-resolution SPECT images in rats[J].Arq Bras Cardiol， 2013，101（1）：59-67.

[3] Zornoff L A， Paiva S A， Minicucci M F， et al.Experimental myocardium infarction in rats：analysis of the model[J].Arq Bras Cardiol，2009，93（9）：434-436.

[4]高琴，關(guān)瑞錦.心力衰竭大鼠模型的制作及意義[J].心血管康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2004，13（1）：27-30.

[5]雷敬輝，康玉明.充血性心力衰竭大鼠模型制備的改進[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2008，39（9）：769-771.

[6] Olivetti G，Capasso J M，Meggs L G，et al.Cellular basis of chronic ventricular remodeling after myocardial infarction in rats[J].Circ Res，1991， 68（12）：856-869.

[7] DerIas N W， Adams C W.Macroscopic enzyme histochemistry in myocardial infarction：use of coenzyme， cyanide， and phenazine methosulphate[J].Clin Pathol，1982，35（13）：410-413.

[8]楊永輝，李彤，趙越，等.一種簡易兔心肌梗死模型的建立[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2012，9（10）：1-3.

[9]盧新林，岳玉霞，嚴泉祥，等.在無創(chuàng)性通氣條件下快速建立小鼠心肌梗死模型的簡易方法[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2014，11（30）：23-26.

[10]李昌繁，江時森.心力衰竭動物模型的研究進展[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2007，20（5）：532-534.

[11] Degabriele N M， Griesenbach U， Sato K， et al.Critical appraisal of the mouse model of myocardial infarction[J].Exp Physiol， 2004， 89（4）：497-505.

[12] Miyahara Y， Nagaya N， Kataoka M.， et al.Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction[J].Nat Med， 2006， 12（4） ：459-465.

[13] Vakeva A P， Agah A， Rollins S A， et al.Myocardial infarction and apoptosis after myocardial ischemia and reperfusion：role of the terminal complement components and inhibition by anti-C5 therapy[J].Circulation， 1998， 97（22）：2259-2267.

[14]姜宗來，胡海濤.大鼠冠狀動脈的解剖觀察[J].解剖學(xué)報，1984，15（2）：136-141.