DNA同源重組機制的確立

向義和

清華大學物理系，北京 100084

DNA同源重組機制的確立

向義和?

清華大學物理系，北京 100084

介紹了DNA同源重組機制確立的過程。其主要內(nèi)容包括基因連鎖和重組現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，交叉假設的提出，斷裂重接假設和復制選擇假設的出現(xiàn)，同源重組的三個模型(Holliday模型、單鏈斷裂模型和雙鏈斷裂模型)的確立。

連鎖基因；同源重組；交叉假設；Holliday模型；單鏈斷裂模型；雙鏈斷裂模型

DNA重組(recombination)是指發(fā)生在DNA分子內(nèi)部或DNA分子之間核苷酸序列的交換、重排和轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，是已有遺傳物質(zhì)的重新組合過程。同源重組(homologous recombination)是在兩個DNA分子的同源序列之間直接進行交換的一種重組形式。進行交換的同源序列可能是完全相同的，也可能是非常相近的。同源生物體通過重組可以產(chǎn)生新的基因或等位基因的組合，還可以提高種群內(nèi)遺傳物質(zhì)的多樣性，而人們可使用同源重組進行遺傳作圖。

本文介紹了DNA同源重組機制確立的過程。20世紀初發(fā)現(xiàn)了基因連鎖和重組現(xiàn)象，在探討重組現(xiàn)象出現(xiàn)的原因時又提出了交叉假設，形成了交換概念。20世紀30年代中期在探討基因交換的機制時，出現(xiàn)了染色體交換的兩種假設：斷裂重接假設和復制選擇假設。1953年DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)后，科學家開始在分子水平上探討同源重組的機制。20世紀60—80年代，科學家分別提出了DNA同源重組的三種模型：Holliday模型，單鏈斷裂模型和雙鏈斷裂模型。

1 基因連鎖和重組現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)

1.1 連鎖現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)

1905年，英國生物學家貝特森(Bateson W., 1851—1926)和龐尼特(Punnet R. C.)研究香豌豆兩對性狀的遺傳。他們選擇的一對性狀是花的顏色，有紫色和紅色兩種；另一對是花粉粒的形狀，有長形和圓形兩種。將紫花長花粉粒和紅花圓花粉粒的植株作親本進行雜交，結(jié)果F1代都是紫花長花粉粒，可見紫花對紅花是顯性，長花粉粒對圓花粉粒是顯性。將F1代自交得到的F2代有紫長、紫圓、紅長、紅圓4種表型。這4種表型的比率不符合孟德爾的兩對遺傳因子的分離比9∶3∶3∶1，其中紫長和紅圓的表型的比率遠遠超出9/16和1/16，而相應的紫圓和紅長的表型卻大大少于3/16(表1)。[1]

表1 香豌豆紫長×紅圓雜交試驗

將實驗數(shù)據(jù)與由孟德爾自由組合定律所預期結(jié)果相比較，F(xiàn)2代中性狀的親本組合類型遠遠多于重組組合的類型。這等于說，兩對基因在雜交子代中的組合并不是隨機的，在F1雜種形成配子時，原來屬于同一親本的兩個基因更傾向于進入同一配子中，有更多保持親本原來組合的傾向，而且這種傾向與顯隱性無關。這是在自由組合定律方面第一次出現(xiàn)的顯著的例外，無疑，這是一個重要的發(fā)現(xiàn)。

1.2 重組現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)

1910年，美國遺傳學家摩爾根(Morgan T. H., 1866—1945)和他的學生布里吉斯(Bridges C. B., 1889—1938)用果蠅進行了大量的雜交試驗，研究了兩對基因的遺傳，發(fā)現(xiàn)了完全連鎖、不完全連鎖和重組現(xiàn)象[1]。

在黑腹果蠅中，灰體(B)對黑體(b)是顯性，長翅(V)對殘翅(v)為顯性，這兩對基因在常染色體上。他們將灰體長翅(BBVV)和黑體殘翅(bbvv)的果蠅雜交，F(xiàn)1代都是灰體長翅(BbVv)。用F1的雜合體進行下列兩種方式的測交，所得到的結(jié)果卻完全不同。①取F1雄蠅(BbVv)和黑體殘翅(bbvv)的雌蠅測交。按兩對基因的自由組合定律來預測，應產(chǎn)生灰體長翅(BbVv)、灰體殘翅(Bbvv)、黑體長翅(bbVv)、黑體殘翅(bbvv)4種表型的后代，且比率為1∶1∶1∶1?？墒菍嶒灥慕Y(jié)果并非如此，而是只有數(shù)目相同的灰體長翅(BbVv)和黑體殘翅(bbvv)兩種類型。②如果用F1雌蠅(BbVv)和黑體殘翅(bbvv)的雄蠅測交，后代中就出現(xiàn)了灰體長翅(BbVv)、灰體殘翅(Bbvv)、黑體長翅(bbVv)、黑體殘翅(bbvv)4種表型，但比率是0.42∶0.08∶0.08∶0.42。

摩爾根的解釋是：假定基因B和V同處于一條染色體上，基因b和v同處于同源染色體的另一條染色體上。他將這種處于同一條染色體上的基因遺傳時較多地聯(lián)系在一起的現(xiàn)象稱為連鎖(linkage)。對于上述第一種測交結(jié)果摩爾根稱為完全連鎖(complete linkage)(圖1)。

由于F1雜合雄蠅(BbVv)完全連鎖，即在同一染色體上的連鎖基因(如B、V基因或b、v基因)100%聯(lián)系在一起傳遞到下一代。因此只產(chǎn)生數(shù)目相等的兩種配子BV和bv，所以和黑體殘翅(bbvv)的雌蠅測交時，后代只能有數(shù)目相等的灰體長翅(BbVv)和黑體殘翅(bbvv)兩種類型(圖1)。

第2種方式的測交，后代出現(xiàn)數(shù)目不等的4種表型，其中親本的類型遠遠多于新類型。摩爾根稱這種連鎖為不完全連鎖 (incomplete linkage) (圖2)。不完全連鎖是指位于同一染色體上的2個或2個以上的等位基因，不總是作為一個整體傳遞到子代。

新類型是由于同源染色體上的不同對等位基因之間重新組合的結(jié)果，這種現(xiàn)象稱為重組(recombination)。在本項測交實驗中，出現(xiàn)的新類型共占16%，該數(shù)值表示基因Bb和Vv之間的重組值(recombination value)或重組頻率(recombination frequency, RF)。重組值用百分數(shù)表示，其計算公式如下：

重組值(RF)=重組型數(shù)目/(親組型數(shù)目＋重組型數(shù)目)

重組值從0～50%變化。重組值的大小反映了個體在側(cè)交中同一條染色體上的基因的連鎖程度。重組值小，親組型基因的連鎖程度大，當重組值是0時，為完全連鎖；重組值大，親組型基因的連鎖程度小，當重組值達到50%，則4種配子成1∶1∶1∶1的比例，也就是自由組合了。

大量的實驗資料表明，連鎖現(xiàn)象在生物界普遍存在。凡是位于同一條染色體上的基因群，均稱為一個連鎖群(linkage group)。摩爾根等在1914年已發(fā)現(xiàn)黑腹果蠅有4個連鎖群，到1967年，在果蠅中至少測定了將近1 000個基因分別屬于這4個連鎖群。在遺傳學上，凡是充分研究過的生物中，連鎖群的數(shù)目都應該等于單倍體染色體數(shù)(n)。

圖1 果蠅的完全連鎖

圖2 果蠅的不完全連鎖

2 交叉假設的提出和交換概念的證實

2.1 交叉假設的提出

在同一染色體上相互連鎖的基因為什么會出現(xiàn)一定頻率的重組？換言之，在兩對基因連鎖遺傳時，形成親代所沒有的新組合的機制是什么?

在摩爾根等確立遺傳的染色體學說之前，1909年比利時的細胞學家詹森斯(Janssens F. A.)在研究兩棲類和直翅目昆蟲的減數(shù)分裂時，觀察到二價體(相互配對的兩條同源染色體，bivalent)的交叉，提出交叉型假設(chiasmatype hypothesis)，這是最早的重組理論。他認為每次交叉都表明父、母本的一條染色單體接觸、斷裂和重接，形成一個新的組合，其他兩條染色單體仍保持完整狀態(tài)。因此每個交叉是重組行為可見的表現(xiàn)形式，其要點是：①生物在形成配子的過程中，都要經(jīng)減數(shù)分裂，在第一次減數(shù)分裂前期，兩個同源染色體配對，形成4條染色單體。配對中的同源染色體不是簡單地平行靠攏，而是在非姊妹染色單體間的某些點上出現(xiàn)交叉纏結(jié)的圖像，每一個點上這樣的圖像稱為一個交叉(chiasma)，這是同源染色體間對應片段發(fā)生過交換(crossing-over)的地方(圖3)。②處于同源染色體的不同座位的相互連鎖的兩個基因之間如果發(fā)生了交換，就導致這兩個連鎖基因的重組。

圖3 配對的同源染色體有兩個交叉，交叉結(jié)處表示非姊妹染色單體間發(fā)生過交換

這個學說的核心是：交叉是交換的結(jié)果，而不是交換的原因。也就是說，遺傳學上的交換發(fā)生在細胞學上的交叉出現(xiàn)之前[1]。

由圖3可見，交換曾發(fā)生在非姊妹染色單體2和3及2和4之間。如果交換發(fā)生在兩個特定的所研究的基因之間，則出現(xiàn)染色體內(nèi)重組，形成交換的產(chǎn)物。否則，交換發(fā)生在所研究的基因之外，則得不到特定基因的染色體內(nèi)重組的產(chǎn)物。

一般情況下，染色體愈長，顯微鏡下可以觀察到的交叉數(shù)愈多。一個交叉就代表一次交換。一般是兩個基因在染色體上的距離越遠，其互換的比率越大；距離越近，互換率越小，

同源重組要求兩個DNA分子的序列同源，同源區(qū)域越長越有利，同源區(qū)太短，越難發(fā)生重組。大腸桿菌染色體重組，至少要求有20～40 bp是相同的。

因此，交換值(crossing-over value)的大小就可以用來表示基因間距離的長短。交換值無法直接測定，而只有通過基因之間的重組頻率來估計所發(fā)生交換的頻率。既然連鎖基因的交換率(即重組頻率)可以代表基因在同一染色體上的相對距離，那么人們就有可能根據(jù)基因的重組頻率來確定它們在染色體上的相對位置。

基因定位(gene mapping)即根據(jù)重組值確定不同基因在染色體上的相對位置和排列順序。遺傳圖(genetic map)或染色體圖(chromosome map)也是依據(jù)基因之間的重組值(或交換值)，確定連鎖基因在染色體上的相對位置而繪制的一種簡單線性示意圖。兩個基因在染色體圖上距離的數(shù)量單位稱為圖距(map distance)。1%重組值去掉其百分率的數(shù)值定義為一個圖距單位(map unit, mu)。后人為了紀念現(xiàn)代遺傳學的奠基人摩爾根，將圖距單位稱為“厘摩”(centimorgan, cM)，1 cM=1%重組值去掉%的數(shù)值。

連鎖和交換這一對名詞在遺傳學上被延用下來。1912年摩爾根提出連鎖互換定律，其基本內(nèi)容是：處在同一染色體上的兩個或兩個以上基因遺傳時，聯(lián)合在一起的頻率大于重新組合的頻率。重組型的產(chǎn)生是由于配子形成過程中，同源染色體的非姊妹染色單體間發(fā)生了局部交換的結(jié)果。

2.2 交叉假設的證實

交叉理論雖然得到遺傳學家的支持，卻遭到細胞學家的反對，因為找不出理論中有關斷裂和重接的任何證據(jù)。從顯微鏡照片上來看確實很難想象存在斷裂和融合的現(xiàn)象。直到1928年，貝林(Belling)提出交換發(fā)生在減數(shù)分裂較早時期，此時同源染色體精密相連，因此在雙線期觀察到的交叉并不表明交換的過程，而是交換的直接結(jié)果，這一解釋結(jié)束了近十年的爭論。但有一個問題仍使人們感到困惑，那就是交叉點是在變化的，在接近細胞分裂中期1時明顯減少了，而交換一旦發(fā)生數(shù)目應是固定的，因此科學家仍然懷疑交叉學說。1931年，英國的植物細胞學家達林頓(Darlington C. D.)發(fā)現(xiàn)，交叉數(shù)目減少是交叉端化的結(jié)果，此時才排除了異議[2]。

1978年蒂斯(Tease C.)和瓊斯(Jones C. H.)采用姊妹染色單體差別染色(SCD)來直接檢驗交叉和重組的關系。SCD法可將姊妹染色單體一條染上顏色呈現(xiàn)深紫色，顯示為暗的；另一染不上色，顯示為明的。他們用SCD法來處理蝗蟲細胞減數(shù)分裂的染色體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)明暗轉(zhuǎn)換發(fā)生在交叉處(圖4)。這就澄清了前面留下的問題。實驗表明交叉正是發(fā)生交換的位點。

圖4 在減數(shù)分裂中非姊妹染色單體深色鏈和淺色鏈之間發(fā)生交換：(a)表明交叉；(b)當著絲粒附著到紡錘絲上拉向兩極時，形成中央帶有交叉的十字形結(jié)構(gòu)；(c)十字形結(jié)構(gòu)的照片

摩爾根在1926年的言論中提到線性排列的基因通過“互換”而重新組合的概念，這種“交換”的真實存在性直到1931年才被芭芭拉?麥克林托克(McClintock B.)在玉米中以及柯特?斯特恩(Stern C.)在果蠅中證實。

3 染色體交換模型

在20世紀30年代中期出現(xiàn)了染色體交換的兩種假設：復制選擇模型和斷裂重接模型。按照復制選擇模型，兩個染色單體作為復制的模板進行復制，在復制過程中相互交換模板，從而造成交換。按照斷裂重接模型，兩個染色單體在同一位置上斷裂，然后彼此和另一染色單體重新連接起來。

3.1 斷裂重接模型

同源重組涉及參與重組的雙方DNA分子的斷裂與重接。人們已從細胞水平上證明在減數(shù)分裂前期，同源染色體配對，兩條非姊妹染色單體之間發(fā)生斷裂、重接和交叉。1937年，達林頓仔細地觀察研究了減數(shù)分裂的過程，提出重組的斷裂和重接的模型。他認為在減數(shù)分裂中一對同源染色體相互分離就像將繩子的兩股分開一樣，會產(chǎn)生扭曲，為了消除張力，只有當兩姊妹染色單體在對應點發(fā)生斷裂才能使張力達到平衡，然后非姊妹染色單體的“斷頭”相互重接，產(chǎn)生了重組。根據(jù)這個模型重組應發(fā)生在四線期，因重組是一個相互的過程，所以重組的產(chǎn)物也應當是對稱的[2]。

染色體斷裂并發(fā)生再連接的最有力的證據(jù)是來自于哈佛大學生物實驗室的分子生物學家梅塞爾森(Meselson M.)和韋格勒(Weigle J.)所做的實驗。1961年，他們用兩個品系的λ噬菌體同時感染大腸桿菌(E. coli)。一個品系λ噬菌體在染色體一端具有標記基因c和mi，這個品系用同位素13C和15N進行標記，因而形成“重”鏈。另一個品系的相應座位帶有c＋和mi＋標記基因，并以12C和14N作為標記，因而具有“輕”的DNA鏈。兩種噬菌體混合感染大腸桿菌細胞后，培養(yǎng)在正常的培養(yǎng)基中，直到裂解。后代噬菌體從裂解細胞中釋放出來，收集后進行子代噬菌體DNA的氯化銫密度梯度離心，結(jié)果獲得了很寬的噬菌體帶。在一系列的條帶中，既有重鏈和輕鏈兩個親本類型的染色體，也有一系列重鏈與輕鏈發(fā)生斷裂重新接合的中間類型。從遺傳標記方面也證明了不僅具有c mi和c＋mi＋親本組合，同時也有c mi＋和c＋mi新組合(圖5)。由此表明，重組的發(fā)生必定是通過DNA的物理斷裂與再接合而實現(xiàn)的[1]。

3.2 模板選擇模型

模板選擇模型是由貝林首先提出的，但1933年他又撤回了這一假設。1948年，赫爾希(Hershey A. D., 1908—1997)發(fā)現(xiàn)在噬菌體的雜交中產(chǎn)生的重組子有時是非對稱的。為了解釋這個現(xiàn)象，他接受了斯特蒂文特(Sturtevant A. H.)的建議，提出了在噬菌體中重組可能不是遺傳結(jié)構(gòu)的斷裂和重接，而是復制時改變了模板所致，即兩條染色單體作為復制的模板，新的染色單體各以一個單體模板進行復制，在復制過程中相應交換模板，從而造成重組(圖6)[2]。

圖5 λ噬菌體的染色體斷裂與重接的證據(jù)：(a)兩個品系的λ噬菌體(c mi,＋＋)感染大腸桿菌；(b)氯化銫密度梯度離心顯示輕鏈親本(上層)、中間類型(中)和重鏈親本(下)三種條帶；(c)兩個標記(c mi)間的交換所產(chǎn)生的重組(c,＋)后代，進一步證明了DNA的斷裂與重接

圖6 斷裂重接模型和選擇復制模型的比較

模板選擇模型能夠很好地解釋基因轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象，因此在20世紀50年代興盛起來。1964年，Holliday模型的提出者霍利德(Holliday R.)[3]在《真菌中基因轉(zhuǎn)換的機制》一文中對模板選擇模型受到支持提出了緣由。他寫道：“模板選擇假設的好處是它做出了幾個十分特別的預測：①基因物質(zhì)的復制是連續(xù)不斷的；②基因配對先于基因復制或與基因復制同時發(fā)生；③如果把這個假設用于解釋交換和轉(zhuǎn)換，并消除通過斷裂和再接合引起的姊妹鏈交換，那么沿著染色體長度連續(xù)的交換應該包含相同的兩個染色單體；④在一個給定的雜合子位置處，從突變體轉(zhuǎn)換到野生型等位基因和從野生型轉(zhuǎn)換到突變體等位基因應該以相同的頻率出現(xiàn)；⑤在相同的基因內(nèi)，在不同的突變體之間的交叉中，轉(zhuǎn)換到野生型等位基因的頻率應該正比于這些突變體之間的距離，于是允許用附加的重組頻率構(gòu)建線性基因圖譜。”接著，霍利德又指出模板選擇模型遇到的困難。他指出：“顯然，預測①～③暫時沒有得到實驗證據(jù)的支持，在別處已經(jīng)充分討論了模板選擇模型的這些困難。此外，累積的證據(jù)不支持預測④。1962年Kaniti等發(fā)現(xiàn)在芽孢顏色突變體和野生型的交叉中，從突變體到野生型等位基因的轉(zhuǎn)換頻率大約是在反方向上轉(zhuǎn)換頻率的1/5……在許多研究中似乎是證明了預測⑤?！盵3]

圖7 同源染色單體的重組和有效配對的各個階段的圖解說明：兩條實線表示染色單體的DNA雙鏈，而兩條虛線表示其他染色單體的DNA雙鏈；箭頭表示這些鏈的極性；水平短線給出基因中斷處或連接處位置

4 同源重組分子機制的確立

4.1 Holliday模型

1964年美國分子生物學家霍利德提出了揭示同源重組關鍵步驟的模型，這是一個解釋同源重組的簡單但在遺傳學歷史上極為重要的模型。它很好地解釋了DNA鏈侵入、分支移位和Holliday聯(lián)結(jié)體拆分等同源重組的核心過程。

Holliday模型的主要內(nèi)容是：①在減數(shù)分裂前期1的雙線期，同源染色體相互靠近，兩條染色單體(雙鏈DNA分子)聯(lián)會(圖7(a))。②兩個DNA分子中兩個方向相同的單鏈(圖7中鏈2和鏈3)，在DNA內(nèi)切酶作用下，在相同的位置上同時被切開。在每個切開的地方雙螺旋稍微解開，釋放出單鏈(圖7(b))。③釋放的單鏈通過和另一分子中沒有斷裂的鏈互補配對，而在兩個DNA分子間進行交換，形成一個由于單鏈交叉使兩個DNA分子連接在一起的結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生了關鍵的重組中間體——Holliday聯(lián)結(jié)體(圖7(c))。④重組過程的完成需要通過切斷交叉點附近DNA鏈以拆分Holliday聯(lián)結(jié)體，恢復兩個DNA分子。Holliday聯(lián)結(jié)體的拆分方式有兩種：第一種方式是相對的鏈2和鏈3，在交叉處第二次被切開并再連接，結(jié)果在斷開處外產(chǎn)生與原來完全相同的兩個非重組DNA，在兩個切口之間的單倍體區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)了基因轉(zhuǎn)換(conversion)，即一個基因使相對位置上的基因發(fā)生相應的變化所致；第二種分離方式是另外兩條鏈，鏈1和鏈4被切開，然后再重新連接，于是會把半條染色單體的互換變?yōu)檎麠l染色單體的互換，由此產(chǎn)生重組的DNA (圖7(d))。

支持 Holliday模型最為有力的證據(jù)是Potter和Dressler使用特殊的方法在電子顯微鏡下看到了Holliday中間體的結(jié)構(gòu)(圖8)。

不久以后，人們對Holliday模型進行了補充，在Holliday聯(lián)接形成之后，引入了聯(lián)結(jié)體的移動步驟：一個Holliday聯(lián)結(jié)體可以通過配對堿基連續(xù)的解鏈和配對而沿著DNA移動。每次移動時，親本DNA鏈上配對堿基斷開，由相同的堿基配對形成重組中間體，該過程稱為分支移位(branch migration)。這種移位提高了交換DNA的長度。如果兩個DNA分子并不完全相同，如同一基因不同的等位基因間常有的少量序列上的差異，發(fā)生在這些區(qū)域的分支移位形成的DNA雙螺旋將帶有1個或若干個序列錯配，這種區(qū)域被稱為異源雙螺旋DNA。

4.2 單鏈斷裂模型

1975年，哈佛大學生物實驗室的分子生物學家梅塞爾森和耶魯大學醫(yī)學院的分子生物和生物化學系教授拉丁(Radding C. M.)在《美國國家科學院院刊》上發(fā)表題為《基因重組的一般性模型》的論文。該文的摘要指出[4]：“對于基因重組提出的一般性模型，它的新的主要特征是假設由單鏈(或不對稱的)轉(zhuǎn)移起始的，在同分異構(gòu)化之后，它可能變?yōu)殡p鏈(或?qū)ΨQ的)交換。從不對稱到對稱的鏈交換的轉(zhuǎn)變可能確定了在任何特別的有機體中一定的特征?！敝劣贖olliday聯(lián)結(jié)接的形成以及后來的拆分，與原來的Holliday模型相比并沒有做多少變動。由此模型可知，在重組事件的起始階段只有一條DNA分子含有非對稱異源雙鏈區(qū)，到后來由于異構(gòu)化和分支遷移才使兩條DNA分子上出現(xiàn)對稱異源雙鏈區(qū)。這一點已由新發(fā)現(xiàn)的異源雙鏈區(qū)上下游部分基因轉(zhuǎn)換頻率和比例的不同而得到證實。

關于單鏈斷裂模型，它的基本內(nèi)容是：①兩個進行重組的DNA分子在同源區(qū)域相應的位點上只產(chǎn)生一個單鏈裂口。產(chǎn)生裂口的鏈被DNA聚合酶催化的新鏈合成取代后，侵入到另一條同源的DNA分子之中，與該分子中的互補序列配對，并在后者中產(chǎn)生了一個單鏈裂口。②如圖9(AP)所示，進一步的鏈轉(zhuǎn)移來自于在箭頭處聚合酶作用和在箭尾處外切核酸酶作用，鏈置換和鏈同化作用協(xié)調(diào)操作的結(jié)果。因為這個反應只在兩個相互作用的分子中的一個上產(chǎn)生一束異源雙鏈DNA，我們稱之為非對稱鏈轉(zhuǎn)移。從聚合作用反應獲得的化學能，迅速地推動這個雙鏈體必要的轉(zhuǎn)動。③酶的解離允許結(jié)構(gòu)Ap重新排列，或同分異構(gòu)化(i)，給出結(jié)構(gòu)Ar，如圖9所示。在結(jié)構(gòu)Ap中，與交換位置相接的這條臂是在親代的構(gòu)型中，而在結(jié)構(gòu)Ar中，這條臂是在重組構(gòu)型中。④由于兩個DNA分子旋轉(zhuǎn)擴散的緣故，在結(jié)構(gòu)Ar中的交叉連接可在任何方向上自由遷移。在另一方面，異源雙鏈DNA可能預先非對稱地形成，現(xiàn)在鏈轉(zhuǎn)移是對稱的，而且可能在兩個分子上形成異源雙鏈DNA(Sr，圖9)。⑤在上一步中產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)Sr可能經(jīng)歷一個比上述過程更加復雜的、可逆的同分異構(gòu)化的過程(i′)，而且也交換兩個側(cè)臂的親本的和重組的構(gòu)型，形成結(jié)構(gòu)Sp。這個結(jié)構(gòu)Sp在物理學上，而不是在遺傳學上，等同于Holliday模型中的對稱性的異源雙鏈DNA結(jié)構(gòu)。通過切開結(jié)構(gòu)Sr也能直接產(chǎn)生結(jié)構(gòu)Sp。如果能夠起始旋轉(zhuǎn)擴散也能獲得這個產(chǎn)物。⑥Holliday結(jié)構(gòu)的同分異構(gòu)化使在交換位置的類似鏈的兩個配對發(fā)生交換，造成它們兩者對內(nèi)切核酸酶的攻擊產(chǎn)生敏感，該酶通過切開交叉鏈而終止這個交換。⑦最后，這個模型像許多其他流行的模型一樣，假定在異源雙鏈區(qū)域中錯誤的堿基配對必須得到酶的修復。

接著，作者描述了同分異構(gòu)化的細節(jié)，如圖10(Ⅰ—Ⅴ)所示。從Holliday結(jié)構(gòu)開始，可以把同分異構(gòu)化設想如下：①在交叉連接處4個堿基配對不堆積，產(chǎn)生了對稱性的結(jié)構(gòu)，如圖10(Ⅱ)所示。②分子ab和AB繞著通過交叉連接處的軸α彼此相對轉(zhuǎn)動180°，就產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)Ⅲ。分子模型的檢驗揭示出這種轉(zhuǎn)動只能在立體空間的意義上才能完成。③分子aB和Ab繞著垂直于第一條軸的第二條軸β彼此相對轉(zhuǎn)動180°，給出了結(jié)構(gòu)Ⅳ。這種轉(zhuǎn)動也只能在立體空間的意義上才能完成。④在這個新的交叉連接的任一邊上堿基配對的再堆積給出了重組結(jié)構(gòu)Ⅴ。

4.3 雙鏈斷裂模型

雙鏈斷裂模型主要是在酵母中獲得的一些實驗數(shù)據(jù)的基礎上提出來的。和Holliday模型一樣，這個過程也是由同源染色體聯(lián)會開始，但在這個模型里，始發(fā)事件是兩條DNA分子中的一條發(fā)生了雙鏈斷裂，而另外一條保持完整。因為雙鏈DNA斷裂較易發(fā)生，與Holliday模型中所提到的同源成對斷裂作為起始事件相比，雙鏈DNA斷裂更有說服力。然而，兩條DNA分子的非對稱始發(fā)斷裂，導致雙鏈DNA斷裂模型的后期重組過程也是非對稱的。雙鏈斷裂模型認為，一個DNA分子上兩條鏈的斷裂才啟動了鏈的交換。兩個重組DNA分子中產(chǎn)生斷裂的雙鏈被稱為受體雙鏈(recipient duplex)，不產(chǎn)生斷裂的被稱為供體雙鏈(donor duplex)。隨后發(fā)生的DNA修復合成及切口連接導致形成Holliday聯(lián)結(jié)[5]。

1983年哈佛大學醫(yī)學院生物化學系史佐斯泰克(Szostak J. W.)等[6]在《細胞》雜志上發(fā)表了題為《重組的雙鏈斷裂修復模型》的論文，提出了雙鏈斷裂啟始重組的模型。具體步驟如圖11所示，由以下5個階段組成[6]：

(1)內(nèi)切核酸酶切開一條染色單體(雙鏈DNA分子)的兩條鏈，導致這個DNA分子雙鏈發(fā)生斷裂，從而啟動重組過程。這個雙鏈斷裂的DNA分子既是啟動重組的“入侵者”，又是遺傳信息的受體(受體雙鏈)。受到外切核酸酶的作用，雙鏈切口擴大而產(chǎn)生具有3′-單鏈末端的空隙。

(2)一個自由的3′-端入侵供體雙鏈DNA分子同源的區(qū)域，形成異源雙鏈。供體雙鏈的一條鏈被取代，另一條鏈提供了修復合成反應的遺傳信息，產(chǎn)生取代環(huán)(displacement loop，D環(huán))。

(3)由入侵的3′-端引發(fā)的DNA修復合成導致D環(huán)延伸。D環(huán)最終大到覆蓋受體雙鏈的整個空隙。新合成的DNA是由被入侵的DNA雙鏈作為模板，于是新合成的DNA序列由被入侵的DNA決定。

(4)當供體雙鏈被取代的鏈到達受體雙鏈空隙的另外一側(cè)，它將和空隙末端的另一個3′-單鏈末端退火。于是被取代的單鏈提供了序列，填補了受體雙鏈一開始被切除的序列。由DNA聚合酶催化的修復合成將供體雙鏈的D環(huán)轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA。DNA連接酶縫合缺口，形成兩個Holliday聯(lián)結(jié)。

圖11 雙鏈斷裂模型

(5)Holliday聯(lián)結(jié)的拆分有兩種可能的途徑：一種途徑是兩個切口一個在內(nèi)側(cè)的鏈，另一個在外側(cè)的鏈，那么分離得到的是交換產(chǎn)物(crossover product)；另一種途徑是兩個切口要么都在內(nèi)側(cè)的鏈，要么都在外側(cè)的鏈，得到的是非交換的產(chǎn)物(non-crossover product)。

1994年美國俄勒岡州立大學分子生物研究所斯塔赫(Stahl F. W.)在《遺傳學》雜志上發(fā)表《Holliday聯(lián)結(jié)30周年》一文。在概述了雙鏈斷裂模型后，作者敘述了雙鏈切口的實驗證明，他寫道：“通過論證減數(shù)分裂重組的啟動，已經(jīng)在酵母菌減數(shù)分裂重組的啟動中證實了雙鏈切口的重要性，由發(fā)源于它們的基因轉(zhuǎn)換的梯度(gradients of gene conversion)推斷出重組的存在，重組位于天然的特殊的減數(shù)分裂的雙鏈切口處。這些切口位置的缺失既消除了這些切口又消除了在它們附近的高速率重組。”接著他敘述了雙鏈斷裂模型與其他兩個模型的關系，寫道：“應該注意這個雙鏈斷裂模型不僅保留了Holliday結(jié)構(gòu)，而且也保留了Meselson-Radding模型的主要特征：①由于在切口位置處產(chǎn)生的3′端伸出，在切口的每一邊上出現(xiàn)了一個非對稱的異源雙鏈DNA的區(qū)域。②一旦形成Holliday聯(lián)結(jié)，它就可能向外滑動，形成一個對稱的異源雙鏈DNA的區(qū)域。”最后作者又談到Holliday聯(lián)結(jié)在三個模型中的作用。作者指出：“Holliday聯(lián)結(jié)的引入，使得該聯(lián)結(jié)已經(jīng)成為重組模型的基礎，因此，生物化學的調(diào)查研究聚焦于此。通過在試管中對分離結(jié)構(gòu)的研究，證實了在Meselson-Radding模型中假設的，由Meselson主張的聯(lián)結(jié)滑動的能力。后來的研究揭示了在細菌中酶促進了這種滑動?！盵7]

(2014年9月12日收稿)

[1] 王亞馥, 戴灼華. 遺傳學[M]. 北京: 高等教育出版社, 2001: 60-65, 197-199.

[2] 徐晉麟, 徐沁, 陳淳. 現(xiàn)代遺傳學原理[M]. 北京: 科學出版社, 2001: 698-701.

[3] HOLIDAY R. A mechanism for gene conversion in fungi [J]. Genetics Research, 1964, 5: 28.

[4] MESELSON M, RADDING C M.A general model for genetic recombination [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 1975, 72: 358-361.

[5] 楊榮武, 鄭偉娟, 張敏躍. 分子生物學[M]. 南京：南京大學出版社, 2007: 135-137.

[6] SZOSTAK J W, ORR-WEAVER T L, ROTHSTEIN R J, et al. The double-strand-break repair model for recombination [J]. Cell, 1983, 333: 25-35.

[7] STAHL F W. The Holliday junction on its thirtieth anniversary [J]. Genetics,1994, 138: 241-246.

(編輯：段艷芳)

The establishment of homologous recombination mechanisms

XIANG Yihe
Department of Physics, Tsinghua University, Beijing 100084, China

The establishment of homologous recombination mechanisms is introduced. The key events include the discover of gene linkage and recombination phenomena, the proposition of chiasmatype hypothesis, the appear of breakage, reunion and copy choice hypothesis, the establishment of three models of homologous recombination: Holliday model, single-strand-break and double-strandbreak repair model for recombination.

linked gene, homologous recombination, chiasmatype hypothesis, Holliday model, single-strand-break model, doublestrand-break model

10.3969/j.issn.0253-9608.2015.04.007

?通信作者，E-mail：xiangyhts@sina.com