宮頸癌細胞系中HPV16 E6、E7及E6/E7基因對STK31基因甲基化狀態(tài)及表達的影響

殷復粉，王 寧，于 嘯 ，畢曉寧，徐小惠，王言奎

青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 青島 266003

宮頸癌細胞系中HPV16 E6、E7及E6/E7基因對STK31基因甲基化狀態(tài)及表達的影響

殷復粉，王 寧，于 嘯 ，畢曉寧，徐小惠，王言奎

青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 青島 266003

背景與目的：絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶31(serine/threonine kinases 31，STK31)基因在人類多種癌癥中扮演重要角色，且STK31基因的表達受其啟動子及第一外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)的影響；病毒感染與腫瘤組織中某些抑癌基因啟動子區(qū)高甲基化有關。本研究旨在探討宮頸癌細胞系中HPV16 E6、E7及E6/E7癌基因對STK31基因甲基化狀態(tài)及表達的影響，以及不同種類甲基轉移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)基因在STK31基因甲基化中的潛在作用。方法：構建外源性HPV16 E6、E7以及E6/E7基因共表達慢病毒，分別感染人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)陰性宮頸癌細胞系HT-3及C33A，獲得穩(wěn)定轉染的細胞系；采用亞硫酸氫鹽基因組測序法(bisulfite genomic sequencing，BGS)和甲基化特異性PCR (methylation-specific PCR，MSP)檢測3種HPV陽性宮頸癌細胞系HeLa、SiHa和CasKi以及HPV陰性宮頸癌細胞系HT-3和C33A轉染前后STK31基因的甲基化狀態(tài)；RT-PCR及蛋白［質］印跡法(Western blot)檢測上述宮頸癌細胞系中STK31基因的表達以及DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b和DNMT3L基因在HPV16轉染前后宮頸癌細胞系及HPV陽性、HPV陰性宮頸癌組織中的表達情況。結果：外源性HPV16 E6、E7以及E6/E7基因可在HPV陰性宮頸癌細胞系中穩(wěn)定表達。3種HPV陽性細胞系HeLa、SiHa和CasKi中STK31基因呈低甲基化狀態(tài)，STK31 mRNA及蛋白質表達陽性；2種HPV陰性細胞系HT-3、C33A中STK31基因則表現(xiàn)為高甲基化狀態(tài)，STK31 mRNA及蛋白質表達缺失；與未感染慢病毒HT-3和C33A細胞系比較，外源性HPV16 E7以及E6/E7表達的HT-3和C33A細胞系STK31基因甲基化程度降低，其mRNA及蛋白質重新表達。DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因在HT-3E6/E7和C33AE6/E7細胞系中mRNA水平分別高于HT-3空載細胞系和C33A空載細胞系，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因的mRNA水平在HPV16陽性宮頸癌組織中的表達高于其在HPV陰性宮頸癌組織中的表達，差異有統(tǒng)計學意義(t=5.997，P＜0.001；t=6.743，P＜0.001；t=7.926，P＜0.001)。DNMT2在HT-3E6/E7和C33AE6/E7細胞系中mRNA表達水平分別低于HT-3空載細胞系和C33A空載細胞系，差異有統(tǒng)計學意義(t=7.451，P＜0.001；t=2.451，P＜0.05)；DNMT2基因轉錄水平在HPV16陽性宮頸癌組織中低于HPV陰性宮頸癌組織(t=9.134，P＜0.001)。DNMT3L mRNA表達水平在宮頸癌細胞系轉染前后及HPV陰陽性宮頸癌組織中的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結論：HPV感染可導致STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)降低，低甲基化狀態(tài)促進該基因表達。STK31基因的表達受其啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)的調(diào)控。HPV16 E7、E6/E7基因可能通過影響DNMT2的表達參與調(diào)控癌基因STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)。

絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶31基因；甲基化；人乳頭病毒16；宮頸癌；生物標志

［Abstract］ Background and purpose: Studies have proved that the serine/threonine kinases 31 (STK31) gene plays important roles in human cancers. The STK31 gene expression was demonstrated to be regulated by the methylation status of its promoter/exon1 region. Viral infection was revealed to be associated with the hypermethylation of some tumor suppressor genes in some tumor samples. The purposes of this paper were to study the roles of HPV16 E6, E7, or E6/ E7 oncogenes in methylation status and expression of the STK31 gene, and potential effects of DNA methyltransferases (DNMTs) on STK31 gene methylation status. Methods: Ectopically-expressed HPV16 E6, E7, or E6/E7 cells were established by transfecting HPV16 E6, E7, or E6/E7 oncogenes with lentivirus vectors into HPV-negative cervical cancer cell lines HT-3 and C33A. Bisulfite genomic sequencing PCR (BGS) combined with TA clone and MSP (methylation-specific PCR) were used to analyze methylation status of the STK31 gene promoter/exon1 region in HPV-positive cervical cancer cell lines (HeLa, SiHa, CaSki), HPV-negative cervical carcinoma cell lines (C33A, HT-3) and the transfected cells. The mRNA and protein expression of STK31, DNMT1, DNMT2, DNMT3a, DNMT3b and DNMT3L were detected by RT-PCR and Western blot. Results: Transfection efficiency was tested by Western blot, which showed that the transfected cells successfully expressed E6, E7, or E6/E7 proteins, respectively. The STK31 gene promoter/exon1 was hypomethylated in HPV-positive cell lines HeLa, SiHa and CasKi resulting in detection of mRNA and protein expression. STK31 gene promoter/exon1 showed hypermethylation leading to silenced expression in the two HPV-negative cervical cancer cells HT-3 and C33A. Compared with primary HT-3 and C33A cells, the methylation status of STK31 promoter/exon1 was down-regulated that led to expression of STK31 in the ectopically-expressed HPV16 E7 and E6/E7 cells. Expressions of DNMT1, DNMT3a and DNMT3b genes at the level of transcription were higher in C33AE6/E7 and HT-3E6/E7 cells than those in C33A-vector and HT-3 vector cells, respectively (P＜0.001). mRNA levels of DNMT1, DNMT3a and DNMT3b were higher in HPV16-positive cervical cancer tissues than those in HPV-negative cervical cancer tissues, respectively (t=5.997, P＜0.001; t=6.743, P＜0.001; t=7.926, P＜0.001). DNMT2 mRNA level was lower in C33AE6/E7 and HT-3E6/E7 cells than those in C33A-vector and HT-3 vector cells, respectively (t=7.451, P＜0.001; t=2.451, P＜0.05). mRNA level of DNMT2 gene was lower in HPV16-positive cervical cancer tissues than in HPV-negative cervical cancer tissues (t=9.134, P＜0.001). There was no statistically significant difference in expression levels of DNMT3L mRNA between cervical cancer cell lines before and after transfection, or HPV16-positive and HPV-negative cervical cancer tissues, respectively (P＞0.05, data not shown). Conclusion: HPV infection leads to the down-regulated methylation status of STK31 promoter/exon1 that results in the expression of STK31. STK31 gene expression is regulated by methylation status of its promoter/exon1 region. HPV16 E7 and E6/E7 oncogenes may influence the methylation status of STK31 gene promoter/exon1 region by regulating the expression of DNMT2.

宮頸癌是女性死亡的主要原因之一，在發(fā)展中國家尤為顯著［1-2］。持續(xù)性高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染與90%宮頸癌相關，且HPV16型是最常見的高危型HPV，并與世界上60%的宮頸癌相關［3-4］。大量研究表明，病毒感染與腫瘤組織中抑癌基因啟動子區(qū)高甲基化有關［5-6］。同樣地，癌基因啟動子區(qū)的異常甲基化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展亦密切相關［7-8］。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶31(serine/threonine kinases 31，STK31)基因是一種癌-睪丸基因，存在于人類多種腫瘤組織，而在正常情況下，僅存在于精細胞及睪丸［9-10］。Kuo等［11］研究發(fā)現(xiàn)，STK31可能與細胞周期調(diào)控有關，并且STK31表達可增加細胞遷移能力與侵襲能力。研究結果發(fā)現(xiàn)，在結腸癌中，STK31基因的表達受到其啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的調(diào)控，STK31基因有助于保持結腸癌細胞的未分化狀態(tài)，并且敲除STK31基因后，通過加強結腸癌細胞的分化程度，抑制體內(nèi)外腫瘤的發(fā)生［12］。目前有關STK31啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化及表達與HPV感染的關系在宮頸癌中的研究鮮見報道。

本研究采用亞硫酸氫鹽基因組測序法(bisulfite genomic sequencing，BGS)及甲基化特異性PCR (methylation-specific PCR, MSP)檢測宮頸癌細胞系中STK31基因啟動子及第1外顯子甲基化狀態(tài)，RT-PCR及蛋白［質］印跡法(Western blot)檢測STK31基因及不同種類甲基轉移酶(DNAmethyltransferases，DNMTs) DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b、DNMT3L等基因在宮頸癌細胞系及相關宮頸癌組織中的表達，旨在探討HPV感染與STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)的關系以及不同種類DNMTs基因在STK31基因甲基化狀態(tài)改變中的潛在作用；明確該基因表達是否受其啟動子甲基化狀態(tài)的調(diào)控；探究STK31基因在宮頸癌中的潛在作用，為HPV相關宮頸癌的診斷、治療提供表觀遺傳學分子機制的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細胞轉染和培養(yǎng)

外源性HPV16E6、E7及E6/E7基因共表達慢病毒由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其克隆載體為LV5，克隆位點是NotⅠ/ BamHⅠ，合成的病毒滴度分別如下：E6為2×108TU/mL，E7為2×108TU/mL ，E6/E7為1×108TU/mL，慢病毒空載體為1×108TU/mL。將整合有外源性HPV16E6、E7及E6/E7基因的慢病毒及慢病毒空載體感染兩種HPV陰性宮頸癌細胞系HT-3及C33A細胞，溫育72 h后進行檢測。用嘌呤霉素篩選感染后的細胞，建立穩(wěn)定感染的細胞系，分別記為HT-3空載、HT-3E6、HT-3E7和HT-3E6/E7、C33A空載、C33AE6、C33AE7和C33AE6/E7。采用Western blot驗證外源性HPV16E6、E7及E6/E7基因在轉染后細胞中的表達。宮頸癌細胞系均用含有10%胎牛血清(購自美國Gibco公司)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基(購自美國Gibco公司)，在37 ℃、飽和濕度、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.2 細胞DNA提取及 DNA亞硫酸鹽修飾

采用飽和酚－氯仿抽提法提取宮頸癌細胞系DNA，1.5%瓊脂糖電泳檢查提取的基因組DNA的完整性，所有基因組DNA經(jīng)紫外分光光度計檢測波長260 nm處吸光度(D)值與波長280 nm處D值比值均在1.9～2.1。將所提取的基因組DNA進行亞硫酸氫鹽修飾，采用德國QIAGEN公司的快速DNA亞硫酸鹽修飾處理劑盒。操作嚴格按照試劑盒說明進行。

1.3 BGS及MSP檢測

BGS及MSP引物采用Methy primer express v1.0軟件設計，具體序列及反應條件見表1。BGS方法檢測宮頸癌細胞系HeLa、SiHa、CasKi、HT-3、C33A、HT-3空載、HT-3E6、HT-3E7、HT-3E6/E7、C33A空載、C33AE6、C33AE7和C33AE6/E7中STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)的甲基化狀態(tài)，其反應體系：TaqHS (5 U/μL) 0.3 μL、10×PCR緩沖液(含Mg2+) 3 μL、dNTPs (2.5 mmol/L) 3 μL、上游及下游引物各(10 μmol) 1.8 μL、0.05 μg亞硫酸鹽修飾后細胞DNA作為模板、去離子水加至30 μL。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定擴增結果。PCR產(chǎn)物送上海邁浦生物科技有限公司進行TA克隆測序。MSP檢測方法用來驗證上述13種宮頸癌細胞系中STK31基因的甲基化狀態(tài)，采用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增結果。引物序列及產(chǎn)物大小見表1。

1.4 RNA提取及熒光定量PCR檢測

TRIzol一步法提取宮頸癌細胞系及宮頸癌組織總RNA，采用瑞士Roche公司的反轉錄試劑盒合成cDNA。實時熒光定量PCR檢測STK31基因及DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b、DNMT3L基因在宮頸癌細胞系及宮頸癌組織中mRNA轉錄表達水平，同時以管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內(nèi)參照，每一個樣本均設3個重復。20 μL反應體系含Mix：10 μL、上下游引物各1 μL、PCR水8 μL、cDNA 1 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共40個循環(huán)。引物序列及產(chǎn)物大小見表1。

1.5 Western blot檢測

常規(guī)方法提取宮頸癌細胞系總蛋白，行SDS-PAGE。HPV16 E6/E7蛋白PVDF轉膜10 V，15 min；STK31蛋白檢測轉膜10 V，30 min。用TBST配置5%脫脂奶粉封閉2 h。一抗為HPV16 E6、E7單克隆抗體(1∶1 000)以及STK31單克隆抗體(1∶1 000)，二抗為辣根過氧化物標記的山羊抗兔抗體(1∶5 000)，加DAB顯色后分析目的蛋白表達情況。本實驗中一抗購自美國Abcam公司，二抗及DAB顯色液購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

表 1 BGS、MSP及RT-PCR所用引物序列及反應條件Tab. 1 The primer sequences and reaction conditions of BGS, MSP and RT-PCR

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。采用t檢驗比較轉染后細胞系HT-3E7與HT-3E6/E7之間、C33AE67與C33AE6/E7之間的STK31 mRNA表達的差異，并比較HPV16E6、E7轉染前后宮頸癌細胞系及HPV陰、陽性宮頸癌之間的DNMTs轉錄水平。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 外源性HPV16 E6、E7及E6/E7蛋白在HPV陰性宮頸癌細胞系HT-3及C33A中穩(wěn)定表達

Western blot檢測結果顯示，轉染后細胞系穩(wěn)定表達HPV16 E6、E7及E6/E7蛋白，轉染效率較高(圖1)。

圖 1 Western blot檢測HPV16 E6、E7及E6/E7轉染效率Fig. 1 The transfection efficiencies of HPV16 E6, E7 and E6/E7 were tested by Western blot

2.2 宮頸癌細胞系轉染前后及HPV陰、陽性宮頸癌組織中STK31基因的甲基化狀態(tài)的差異

BGS擴增PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后可觀察到499 bp的特異性目的片段。電泳結果見圖2。TA克隆后，分別選取13種宮頸癌細胞系各6個陽性克隆進行測序，檢測STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)CpG位點的甲基化狀態(tài)。結果表明，其甲基化率在3種HPV陽性細胞系HeLa(46.4%)、SiHa(50.0%)和CasKi(49.1%)中低于2種HPV陰性宮頸癌細胞系HT-3(98.2%)和C33A(95.5%)；HT-3空載及C33A空載分別與HT-3、C33A細胞系比較，STK31啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)未見明顯改變；HPV16 E6、E7及E6/E7異位表達細胞系中，HT-3E7、HT-3E6/E7、C33AE7和C33AE6/E7細胞系中STK31基因甲基化水平較轉染前細胞系明顯下降，而轉染后細胞系HT-3E6、C33AE6中STK31基因甲基化狀態(tài)較轉染前細胞系則未見明顯改變。具體結果見圖3。圖4為截取的HPV陰性宮頸癌細胞系C33A部分序列測序信號結果，未見套峰及雜峰現(xiàn)象，測序結果準確可靠。

宮頸癌細胞系中STK31基因啟動子及第1外顯子MSP檢測結果與BGS一致，在HPV陽性宮頸癌細胞系HeLa、SiHa、Caski及轉染后細胞系HT-3E6/E7、C33AE6/E7中只出現(xiàn)U條帶；在2種HPV陰性細胞系HT-3、C-33A，及HT-3空載、HT-3E6、C33A空載和C33AE6細胞系中只檢測到M條帶；在轉染后細胞系HT-3E7、C33AE7中出現(xiàn)M+U條帶。MSP檢測54例HPV16陽性宮頸癌組織及17例HPV陰性宮頸癌組織中STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)。結果顯示，其在HPV16陽性宮頸癌組織中的甲基化率(15/54)明顯低于HPV陰性宮頸癌組織(10/17)。差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.463，P=0.019，表2，圖5)。

2.3 宮頸癌細胞系中HPV感染通過調(diào)節(jié)STK31基因啟動子及第1外顯子甲基化狀態(tài)影響其基因的表達

RT-PCR電泳結果見圖6A，Western blot檢測結果見圖6B。在3種HPV陽性宮頸癌細胞系HeLa、SiHa和CasKi中可檢測到STK31基因的表達、STK31基因在2種HPV陰性宮頸癌細胞系HT-3和C-33A中表達缺失；整合有HPV16 E6、E7及E6/E7癌基因的慢病毒轉染HPV陰性細胞系HT-3和C33A后，STK31基因在轉染后細胞系HT-3E7、HT-3E6/E7、C33AE7和C33AE6/ E7中重新表達，而在轉染后細胞系HT-3E6和C33AE6中未檢測到STK31基因表達；STK31基因在HT-3E6/E7和C33AE6/E7細胞系中轉錄水平分別高于HT-3E7和C33AE7。差異有統(tǒng)計學意義(t=2.422，P=0.036；t=7.158，P＜0.001，圖7)。

2.4DNMT、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b和DNMT3L基因mRNA在外源性HPV16E6/E7轉染前后宮頸癌細胞系及HPV陰陽性宮頸癌標本中表達水平的比較

熒光定量PCR法檢測結果顯示，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b在HT-3E6/E7和C33AE6/ E7細胞系中mRNA水平分別高于HT-3空載和C33A空載細胞系。差異有統(tǒng)計學意義(t=8.134，P＜0.001；t=6.134，P＜0.001；t=8.971，P＜0.001；t=6.543，P＜0.001；t=5.164，P＜0.001；t=8.997，P＜0.001)；DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因的mRNA水平在HPV16陽性宮頸癌組織中的表達高于HPV陰性宮頸癌組織(t=5.997，P＜0.001；t=6.743，P＜0.001；t=7.926，P＜0.001)。DNMT2基因在HT-3E6/ E7和C33AE6/E7細胞系中mRNA表達水平分別低于HT-3空載C33A空載。差異有統(tǒng)計學意義(t=7.451，P＜0.001；t=2.451，P＜0.05)；DNMT2轉錄水平在HPV16陽性宮頸癌組織中低于HPV陰性宮頸癌組織(t=9.134，P＜0.001)。DNMT3L mRNA表達水平在宮頸癌細胞系轉染前后及HPV陰陽性宮頸癌組織中的表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖8)。

圖 2 BGS檢測13種宮頸癌細胞系中STK31基因甲基化電泳結果Fig. 2 BGS results of STK31 gene promoter/exon1 methylation status in cervical cancer cell lines

圖 3 宮頸癌細胞系轉染前后STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)TA克隆測序結果Fig. 3 CpG methylation status of STK31 gene promoter/exon1 in cervical cancer cell lines before and after transfection with lentivirus vectors detected by TA clone.

圖 4 HPV陰性細胞系C33A中STK31基因啟動子區(qū)部分位點甲基化狀態(tài)測序結果Fig. 4 Sequencing results of STK31 gene promoter/exon1 in C33A cells

表 2 宮頸癌組織標本中STK31基因甲基化狀態(tài)與HPV感染之間的關系Tab. 2 Correlations between STK31 methylation and HPV infection in human cervical cancers

圖 5 MSP檢測13種宮頸癌細胞系中STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化電泳結果Fig. 5 MSP results of STK31 gene promoter/exon1 in 13 cervical cancer cell lines

圖 6 RT-PCR和Western blot檢測13種宮頸癌細胞系中STK31基因轉錄和翻譯Fig. 6 mRNA and protein expression of STK31 gene in 13 cervical cancer cell lines detected by RT-PCR and Western blot

圖 7 熒光定量PCR方法比較不同細胞系中STK31基因表達差異Fig. 7 Real-time fluorescent quantitative PCR (qPCR) was used to compare STK31 gene expression in different cell lines

圖 8 qPCR檢測DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b和DNMT3L基因的mRNA在外源性HPV16 E6/E7轉染前后宮頸癌細胞系及HPV陰陽性宮頸癌標本中表達水平Fig. 8 mRNA expression of DNMT1, DNMT2, DNMT3a, DNMT3b and DNMT3L genes in cervical cancer cell lines before and after HPV16 E6/E7-lentivirus transfection, and in HPV16-positive and HPV-negative cervical cancer samples

3 討 論

高危型HPV感染是宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的重要條件，雖然HPV感染在女性中十分常見，只有很小比例的HPV感染者發(fā)展為侵襲性宮頸癌。因此，宮頸涂片檢測出HPV陽性的診斷及預后價值就有所減小。研究表明，HPV中兩種致癌蛋白E6、E7可通過不同的途徑，在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用［4,13-14］。HPV感染與某些抑癌基因或癌基因的異常甲基化密切相關，因此，探索一組新的、腫瘤特異性的、具有更高敏感性及特異性的生物學標志，如甲基化相關的生物學標志，則有助于早期發(fā)現(xiàn)宮頸癌，提高沒有條件定期做宮頸涂片篩查者的安全性，預測高危型HPV感染者的預后，指導HPV相關性腫瘤的治療［15-16］。

本實驗研究結果顯示，HPV陽性宮頸癌細胞系中STK31基因甲基化水平低于HPV陰性宮頸癌細胞系，HPV16E7及E6/E7異位表達的HPV陰性細胞系中STK31基因甲基化程度降低，且STK31基因甲基化程度在HPV16陽性宮頸癌組織中低于HPV陰性宮頸癌組織，表明HPV感染可能影響STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)。由此推測，通過聯(lián)合檢測STK31基因的甲基化狀態(tài)，可以提高HPV檢測的特異性，為進一步HPV相關性腫瘤的診斷、預后及治療等提供理論依據(jù)。

STK31基因表達受到其啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)的調(diào)控，高甲基化水平抑制該基因表達。雖然轉染后細胞系HT-3E6和C33AE6中STK31基因甲基化狀態(tài)及其表達情況分別較轉染前無明顯改變，HT-3E6/E7和C33AE6/E7的表達分別高于HT-3E7和C33AE7細胞系，提示HPV16 E6可能對STK31的表達同樣起一定的調(diào)控作用。

DNA甲基化過程是在DNMTs的催化作用下發(fā)生的。目前已研究報道的DNMTs主要有3 種，包括DNMT1、DNMT2和DNMT3，不同種類的DNMTs在DNA甲基化過程中起不同的作用。DNMT1在細胞分裂中起重要的、維持基因甲基化狀態(tài)的作用，與一些腫瘤抑制基因的甲基化有關，在腫瘤的診斷與治療中具有重要的潛在性作用［17-19］。DNMT2具有微弱的DNMT活性，其主要具有天門冬氨酸t(yī)RNA的甲基轉移酶活性［20］，雖然DNMT2在原生生物、植物、真菌和動物中具有高度同源性，是最保守的DNMT蛋白，令人感興趣的是，DNMT2的功能至今研究報道較少［21］。DNMT3主要分為3類，即DNMT3a、DNMT3b和DNMT3L。DNMT3a與DNMT3b具有相似的結構，參與DNA從頭甲基化，DNMT3L單獨沒有催化能力，但可以與DNMT3a、DNMT3b相互作用調(diào)節(jié)其活性。

本研究結果表明，DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因轉錄水平在異位性表達HPV16 E6/ E7的慢病毒轉染后細胞系高于無編碼HPV16 E6/ E7的慢病毒空載體轉染后細胞系，且DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因的mRNA表達在HPV16陽性宮頸癌組織高于HPV陰性宮頸癌組織；而STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化率在異位性表達HPV16 E6/E7的慢病毒轉染后細胞系低于慢病毒空載體轉染后宮頸癌細胞系，STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化率在HPV陽性宮頸癌組織中低于HPV陰性宮頸癌組織，表明DNMT1、DNMT3a和DNMT3b可能不參與癌基因STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)的調(diào)控。研究報道表明，DNMT1主要參與一些抑癌基因的甲基化，且DNMT1高表達總是會伴有基因組和癌基因的低甲基化，或抑癌基因的高甲基化［20，22］；STK31基因是一種癌基因，其甲基化率在DNMT1相對高表達的HPV16陽性的宮頸癌細胞系及宮頸癌組織中低于在DNMT1相對低表達的HPV陰性宮頸癌細胞系及宮頸癌組織。實驗結果與上述研究報道結果相符。DNMT2 mRNA水平在異位性HPV16E6/E7表達的細胞系中低于HPV陰性宮頸癌細胞系，且DNMT2甲基轉錄水平在HPV16陽性宮頸癌組織中低于HPV陰性宮頸癌組織，STK31基因甲基化水平在HPV16E6/E7轉染后細胞系及HPV16陽性宮頸癌組織中分別低于慢病毒空載體宮頸癌細胞系及宮頸癌組織，表明STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化轉移酶可能是DNMT2分子，HPV16 E6、E7可能通過影響DNMT2的表達參與調(diào)控癌基因STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)；DNMT2具有微弱的DNMT活性，其表達差異與STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)相關。本研究推測，DNMT2可能參與某些癌基因甲基化狀態(tài)的調(diào)控。

研究證實，STK31基因的表達受到其啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的調(diào)控，可通過抑制細胞凋亡，保持細胞的未分化狀態(tài)等機制在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［11-12］。STK31是一種癌-睪丸基因，存在于多種腫瘤中，在正常組織僅存在于睪丸及精細胞。睪丸是一個免疫豁免器官，用特異性的T細胞靶向性的識別癌-睪丸抗原不會引起其他不良反應。因此，癌-睪丸抗原可能在人類腫瘤中是一個潛在的診斷性、治療性、預后性的生物學標志［23］。我們推測，開展STK31抗原在宮頸癌中免疫學特性的研究，可以為STK31基因在宮頸癌免疫學治療中的潛在作用提供線索與理論依據(jù)。

本研究初步證實了HPV感染，尤其是HPVE6、E7及E6/E7可能通過調(diào)控STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)來影響宮頸癌中STK31基因表達，清除HPV感染可能通過減弱對其靶基因STK31的表達促進作用，發(fā)揮腫瘤抑制作用；HPVE6、E7及E6/E7可能通過影響DNMT2的表達來調(diào)控STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)，當然還需要進一步的實驗，如Western blot等；但仍有許多問題需要進一步深入研究，如STK31基因啟動子及第1外顯子異常甲基化與宮頸癌侵襲性及轉移性的關系及相關具體機制，STK31抗原在宮頸癌中的免疫學特征等?？傊琒TK31基因異常甲基化可能是HPV感染相關宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的一個新的甲基化相關的分子生物學標志物，并有望用于腫瘤的早期診斷、預后分析和治療指導。因而對STK31基因的進一步深入研究，有助于為宮頸癌的診斷和治療提供新的思路及理論依據(jù)。

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“惠爾血支持按時足劑量化療”2015年度有獎征文通知

眾所周知，按時足劑量化療對于改善癌癥（乳腺癌、淋巴瘤、卵巢癌、結直腸癌及非小細胞肺癌等）患者的預后具有重要意義。然而，大多數(shù)的化療方案存在一定的血液毒性，極大程度地降低了患者完成按時足劑量、足療程化療的比例。惠爾血（重組人粒細胞刺激因子）從20世紀90年代面世至今，造福了數(shù)以百萬計的癌癥化療患者。

為進一步探索并評估惠爾血支持按時、足劑量、足療程化療的臨床效果，促進臨床經(jīng)驗交流，《中國癌癥雜志》特舉辦“惠爾血支持癌癥患者按時足劑量化療有獎征文”活動，現(xiàn)將征文活動事項通知如下：

征文內(nèi)容：

⑴ 惠爾血應用于癌癥患者，支持癌癥患者完成按時足劑量化療的多病例、分組研究等臨床研究，其中患者類型及化療方案不限。

⑵ 惠爾血支持按時足劑量化療的個案報道（個案報道要求特異性與新穎性）。

⑶ 惠爾血在不同的化療方案中的作用等。

征文要求及提交：

⑴ 為首次投稿，未公開發(fā)表過。

⑵ 征文格式參照《中國癌癥雜志》稿約要求，撰寫論文。

⑶ 請將論文電子文檔，通過郵件發(fā)送至：kirin2015zwhd@163.com（注明“征文活動”）。

⑷ 請注明作者、單位、地址、職稱、郵編和聯(lián)系電話等信息。

征文截止日期：

截止日期為2015年12月31日（以E-mail發(fā)出時間為準）。

評選方法：

⑴ 由《中國癌癥雜志》編輯部組織專家成立評審委員會，以公正、公平的方式評選，在征文截稿后評選2015年度獲獎論文。設立一等獎2名，二等獎5名，三等獎15名，并頒發(fā)獲獎證書。

⑵ 獲獎論文經(jīng)《中國癌癥雜志》審稿通過后可優(yōu)先在《中國癌癥雜志》上發(fā)表。

⑶ 一等獎獲得者可獲資助參加歐美學術會議一次；二等獎獲得者可獲資助參加亞太學術會議一次；三等獎獲得者可獲資助參加國內(nèi)學術會議一次。

⑷ 全部論文將以《中國癌癥雜志》編輯部名義頒發(fā)證書，并編入《論文匯編》。

《中國癌癥雜志》編輯部

協(xié)和發(fā)酵麒麟（中國）制藥有限公司

The roles of HPV16 E6, E7 and E6/E7 genes in STK31 promoter/exon1 methylation and expression levels in cervical cancer cell lines

YIN Fufen, WANG Ning, YU Xiao, BI Xiaoning, XU Xiaohui, WANG Yankui

(Department of Obstetrics and Gynecology, Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong, China)
Correspondence to: WANG Yankui E-mail: qdwykpro@163.com

Serine/threonine kinases 31 gene; Methylation; HPV16; Cervical cancer; Biomarker

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.09.001

R737.33

A

1007-3639(2015)09-0641-11

2015-04-18

2015-08-10）

國家自然科學基金(81172480)。

王言奎 E-mail:qdwykpro@163.com