高效液相色譜-質譜聯(lián)用法在分析檢測中的運用分析

關金龍

（西華大學生物工程學院，四川成都610039）

0 引言

高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術（high performance liquid chromatography andmassspectrometry，HPLC/MS）是以高效液相色譜為分離手段，以質譜為鑒定工具的一種分離分析技術。20世紀70年代，自Horning對高效液相色譜-質譜技術進行了開創(chuàng)性的研究，到20世紀90年代出現(xiàn)了被廣泛接受的商品接口及成套儀器[1]，它將高效液相色譜對復雜樣品的高分離能力與質譜具有的高選擇性、高靈敏度以及能夠提供分子量與結構信息的優(yōu)點結合起來，逐漸成為強有力的分析技術方法[2-12]。

1 液相色譜-質譜的優(yōu)點

在液相色譜-質譜技術（LC-MS/MS）中，質譜可對復雜樣品進行分析，即使在液相色譜難以分離的情況下，只要通過質譜儀1及質譜儀2對目標化合物進行中性碎片掃描，則可發(fā)現(xiàn)并突出混合物中的目標化合物，其結果可顯著提高信噪比。

在藥代動力學研究方面，LC-MS/MS與傳統(tǒng)的方法相比，其具有一系列優(yōu)點：（1）對生物樣品的提取、純化和濃縮等前處理過程沒有嚴格要求；（2）具有極高的靈敏度，特別適合進行痕量分析；（3）對蛋白質可實現(xiàn)快速高靈敏度鑒別和測定；（4）可實現(xiàn)微量、高通量樣品分析；（5）檢測所需時間短、回收率高、專屬性強。

2 分析方法

2.1 質譜條件確立

當使用液質聯(lián)用儀對某一化合物進行定量分析時，需要建立一個質譜分析方法，主要考慮以下幾種因素：

2.1.1 化合物的性質

化合物的性質包括化合物的結構、化合物的極性及化合物的pKa值。首先，通過了解化合物的結構，可以大概推斷其碎片離子的斷裂方式，選擇較為穩(wěn)定的碎片離子作為定量反應的子離子，也可以根據經驗判斷選用哪種離子源更為合適；其次，根據化合物的極性大小，可以選擇一種或幾種恰當的溶劑作為溶媒，既能保證完全將樣品溶解，又能提高化合物的質譜響應；最后，了解清楚化合物的pKa值，有助于選擇流動相的添加劑及其pH值，從而提高質譜響應值。

2.1.2 流動相添加劑的選擇

在液質分析中，基于質譜檢測的原理，只能使用可揮發(fā)的酸堿或緩沖鹽，種類就會受到極大的限制。在日常分析中使用到的添加劑主要有甲酸、乙酸、三氟乙酸、氨水和甲酸銨、乙酸銨等緩沖鹽。

2.1.3 質譜離子源的選擇

質譜出現(xiàn)早期，主要的離子源有電子轟擊源（EI）、化學電離源（CI）、電噴霧電離源（ESI）和大氣壓化學電離源（APCI）。隨著科學技術的進步，離子源的發(fā)展也是日新月異。目前，用于定量的離子源主要是電噴霧電離源（ESI）和大氣壓化學電離源(APCI)。

2.2 色譜條件的建立

在液質分析中，經常使用多反應監(jiān)測（MRM/SRM）對化合物進行定量，由于MRM要求選擇2次離子，因此具有很高的專屬性?；谶@點對多個化合物同時進行檢測時，不需要彼此間達到完全分離就可以進行定量分析。

2.3 內標的選擇

檢測時，使用內標物的目的是消除操作誤差，因此在進行生物樣品分析時必須選擇一個合適的化合物作為內標物。LC-MS/MS法的高專屬性使其對內標物與待測物的色譜分離要求不高，但要求內標物與待測物的色譜行為及提取回收率，尤其是質譜信號響應值接近，并要求在測定過程中內標物受系統(tǒng)誤差及碰撞壓力變化的影響與待測物一致。因此，理想的內標物應為待測組分的同位素標記物，但由于同位素標記物價格非常昂貴且不易獲得，可嘗試選用結構相似的化合物（或者同系物）作為內標物。

3 LC-MS/MS技術在分析檢驗中的應用

LC-MS/MS聯(lián)用技術以其高靈敏度、高分離能力和極強的專屬性等特點，且其儀器自動化、普及化程度越來越高，使其被廣泛地應用于環(huán)境分析、藥物分析和食品分析等眾多領域。

3.1 天然藥物化學成分分離和鑒定

高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術在天然藥物成分分析研究中已經得到了廣泛的應用。

He等[13]利用高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術成功地對姜的辛辣成分與含油樹脂提取物進行了成功分析，成功地鑒定了其中7個化合物結構。

3.2 藥物動力學和藥物代謝產物研究

中藥制劑成分復雜多樣，含量一般較低，而高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術的專一性及靈敏度對中藥的藥代動力學研究具有重要意義。

M.Jemal等[14]綜述了藥物研究中用高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術進行高通量生物分析的發(fā)展，艾路等采用高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術鑒定了方劑中烏頭類的生物堿含量。

3.3 中藥指紋圖譜研究

高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術的應用為藥材及其制劑的鑒別及質量評價提供了更加全面、可靠的依據。

余靜[15]等采用高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術對刺五加藥材水溶性和脂溶性成分進行了指紋圖譜研究。

3.4 藥物殘留分析

食品中的農藥殘留量及其有害成分的含量甚微需要對其進行痕量分析。高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術具有極高的靈敏度，可鑒別和測量各種類型的農藥以及生物毒素等殘留物。

Yoshioka等[16]應用高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術同時分析了柑橘果實中的4種催熟劑。

3.5 臨床診斷研究

Orhan等[17]建立了采用高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術同時檢測3種氧化產物的方法。

4 結語

高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術的發(fā)展，以其靈敏、快速、高效等特點，在對含量少、不易分離得到或缺乏紫外吸收的物質的分析中顯示了獨特的優(yōu)勢。

綜上所述，高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術在分析檢測方面應用前景廣闊，將在現(xiàn)代分析檢測研究領域發(fā)揮越來越重要的作用。

［1］孟兆玲，齊元英，柳仁民.高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術的應用進展［J］.化學分析計量，2006，12（6）

［2］王正范，楊樹民，吳伴天，等.色譜聯(lián)用技術［M］.北京：化學工業(yè)出版社，2001

［3］Lee M S,Kemrs E H.LC/MS application in drug development［J］.Mass Spect romet ry Reviews,1999，18（5）

［4］Emrer J,Vogel M.Application of hyphenated LC-MS techniques in pharmaceutical analysis［J］.Biomedical Chromatography,2000，14（8）

［5］張均田.現(xiàn)代藥理實驗方法［M］.北京：北京醫(yī)科大學中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社，1998

［6］Oliveari E J,Watson D G.Liquid chromatography-mass spect romet ry in the study of the metabol ism of drugs and other xenobiotics［J］.Biomedical Chromatography，2000，14（3）

［7］ Corcoran O,Nicholson JK，Lenz E M,etal.Direct ly coupled liquid chromatography with inductively coupled plasma mass mass spect romet ry and or thogonal accel-rat ion timeof-f l ight mass spect romet ry for the identif ication of drug metabol ites in urine:appl ication to diclofenac using chlor ine and sul fur detection［J］.Rapid Communications and Mass Spect romet ry,2000，14（2）

［8］ Chen L,Wang J,Liu X H,etal.Novel rearrangement of smal l peptides in electropsry ionization tandem mass spectrometry［J］.Chinese Journal of Chemistry，2004（1）

［9］邢杰，宮平，鐘大放，等.西地那非哌啶衍生物的負離子電噴霧多級質譜研究［J］.質譜學報，2002，23（8）

［10］Emrer J.The use of hyphenated LC-MS technique for characterization of impurity profiles during drug development［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical analysis，1998，18（12）

［11］王穎，盛龍生，張正行，等.表阿霉素中有關物質的LC/ESI/MS分析［J］.藥物分析雜志，2001，21（3）

［12］郭繼芬，鐘大放，陳笑艷.液相色譜-質譜聯(lián)用法鑒定9種皮質激素藥物［J］.藥學學報，1999，34（8）

［13］He X G,Bernart M,Lian L,et al.High-per formance liquid chromatography-elect ros pray mass spect romet ric analysis of pungent constituents of ginger ［J］.Journal of Chromatogr A,1998，796（2）

［14］ Jemal M.High-throughput quanti tative bioanalysis by LC-MS/MS［J］.Biomedical Chromatography,2000，14（2）

［15］余靜.刺五加的HPLC/UV/MS指紋圖譜研究［J］.中國藥科大學報，2003，34（2）

［16］ Yoshioka N,Akiyama Y,Teranishi K.Rapid simul taneous determination of o-phenylphenol,diphenyl,thiabendazole,imazal i l and its major metabolites in cit rus f ruits by liquid chromatography-mass spectrometry using atmospheric pressurephotoiozation［J］.Journal of Chromatogr A,2004，1022（12）

［17］Orhan H,Vermeulen N P,Tump C.Simul taneous determination of tyrosine,phenylalanine and deoxy-guanosine oxidation products by l iquid chromatography-tandem mass spect romet ry as noninvasive biomarkers for oxidative damage［J］.Journal of Chromatography B，2004，799（2）