引入豬種與合作藏豬mtDNA D-loop的遺傳多樣性

趙生國， 劉麗霞, 鄭王山, 權(quán)金強(qiáng), 汪文強(qiáng), 郭永博, 李永青, 焦 婷, 蔡 原

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

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引入豬種與合作藏豬mtDNA D-loop的遺傳多樣性

趙生國1， 劉麗霞2, 鄭王山1, 權(quán)金強(qiáng)1, 汪文強(qiáng)1, 郭永博1, 李永青1, 焦 婷3, 蔡 原1

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

測定并分析了杜洛克豬、長白豬和大白豬3個(gè)引入豬種及合作藏豬共178個(gè)個(gè)體的線粒體DNA D環(huán)(mtDNA D-loop)高變區(qū)核苷酸序列，研究引入豬種對合作藏豬遺傳資源的影響.結(jié)果表明：合作藏豬核苷酸多樣度和平均核苷酸差異系數(shù)均低于杜洛克豬和大白豬，僅高于長白豬，而其單倍型多樣度高于3個(gè)引入豬種.單倍型分析結(jié)果表明：合作藏豬僅分布在亞洲單倍類，杜洛克豬和大白豬同時(shí)具有亞洲和歐洲兩個(gè)單倍類，歐洲起源豬種沒有入侵到合作藏豬母系.

合作藏豬; 線粒體DNA D環(huán); 單倍型; 遺傳多樣性

合作藏豬與其他豬種相比具有獨(dú)特的種質(zhì)資源特征.細(xì)胞遺傳學(xué)研究表明，藏豬染色體帶型與其他豬種相比存在特異染色體帶型[5]，而且在藏豬的β-珠蛋白[6]、MHC-DQB1[7]和Myogenin[8]的基因中發(fā)現(xiàn)了豐富的遺傳多樣性.這可能是由于藏豬屬于高原放牧型品種，人工選擇對其影響較小，使其能夠長期保持原始血統(tǒng)，同時(shí)在自然條件下產(chǎn)生的突變類型能夠保留并積累在群體中.但也有研究表明，中國個(gè)別地方品種和一些國外品種豬的遺傳多樣性呈下降趨勢[9-11].對迪慶、甘孜、阿壩、合作和西藏藏豬群體線粒體D環(huán)(mitochondrial DNA D-loop, mtDNA D-loop)序列分析發(fā)現(xiàn)，除合作藏豬群體外，其他幾個(gè)群體的遺傳變異相對比較低[12].這說明可能由于人工選擇導(dǎo)致中國家豬遺傳多樣性下降[13]，特別是高強(qiáng)度選擇豬種對地方豬種雜交產(chǎn)生的后果更為嚴(yán)重.

本試驗(yàn)以mtDNA為分子標(biāo)記，開展杜洛克豬、長白豬、大白豬和合作藏豬的遺傳多樣性研究，比較不同來源豬種遺傳資源的差異，旨在為我國地方豬種的資源保護(hù)提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

采集合作藏豬(59頭)、杜洛克豬(36頭)、長白豬(42頭)和大白豬(41頭)共178頭的豬耳(尾)組織樣品.采用傳統(tǒng)的酚氯仿抽提法[14]進(jìn)行基因組DNA的提取.

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)發(fā)表在GenBank中的沂蒙黑豬mtDNA全序列(AF486868.1)[15]，采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0 (http://www.premierbiosoft.com)對豬mtDNA D-loop高變區(qū)擴(kuò)增引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)如下引物序列.上游引物P-L16337：5′-TAGAACACCCATTCATCATC-3′；下游引物P-H1356：5′-CGTTATGAGCTACCGTTATA-3′.引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成.

1.3 PCR反應(yīng)

PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性20 s、55.6 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后于72 ℃延伸10 min.擴(kuò)增產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，檢測的目的產(chǎn)物由上海生工生物技術(shù)有限公司完成測序.

值得注意的是，在調(diào)查統(tǒng)計(jì)中，居住支出包括房租、水、電、燃料、物業(yè)管理等方面的支出，也包括自有住房折算租金，但沒有包括購買住房的支出，因此實(shí)際居住的支出是被嚴(yán)重低估的。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Chromas 2.3軟件(http://www.technelysium.com.au/chromas.html)對原始序列進(jìn)行編輯，并通過MEGA 5.0軟件(http://www.megasoftware.net)[16]建立數(shù)據(jù)庫后用Clustal X軟件(http://www.igbmc.ustrasbg.fr/pub/ClustalX)進(jìn)行同源序列比對分析，采用軟件包Dnasp 4.10(http://www.ub.es/dnasp)進(jìn)行遺傳多樣性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 mtDNA D-loop高變區(qū)的核苷酸多樣度

通過測序獲得合作藏豬、杜洛克豬、長白豬和大白豬共178個(gè)個(gè)體的mtDNA D-loop高變區(qū)長度為438 bp的核苷酸序列.采用Dnasp 4.10軟件進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，4個(gè)豬群存在19個(gè)變異位點(diǎn)(2個(gè)是單一變異位點(diǎn)，17個(gè)是簡約信息位點(diǎn))，并由此界定了17個(gè)單倍型.遺傳多樣性分析結(jié)果如表1所示.

表1 4個(gè)豬群的遺傳多樣性

從表1可以看出，合作藏豬的單核苷酸變異位點(diǎn)數(shù)(8個(gè))介于大白豬(16個(gè))、杜洛克豬(15個(gè))與長白豬(4個(gè))之間，說明選育豬種杜洛克豬和大白豬的核苷酸變異比較豐富，而合作藏豬顯得比較低.反映遺傳多樣性的核苷酸多樣度和平均核苷酸差異系數(shù)與單核苷酸變異位點(diǎn)數(shù)的分析結(jié)果類似，這些結(jié)果表明合作藏豬核苷酸變異水平低于杜洛克豬和大白豬，僅高于長白豬.

2.2 mtDNA D-loop高變區(qū)的單倍型

采用Dnasp 4.10軟件進(jìn)行單倍型分析及其頻率計(jì)算的結(jié)果(表2)表明，4個(gè)豬群的17個(gè)單倍型中存在5個(gè)共享單倍型，其中有兩個(gè)(H1和H3)是4個(gè)豬群的共享單倍型.在12個(gè)特有單倍型中，合作藏豬的單倍型最多，達(dá)到8個(gè)，而杜洛克豬和大白豬分別只有3和1個(gè)；長白豬沒有發(fā)現(xiàn)其特有的單倍型.顯然，外來選育豬種的特有單倍型數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于地方豬種，這可能是由于在高強(qiáng)度的選育過程中，繁殖母豬的單一母系來源造成此結(jié)果.

表2 4個(gè)豬群的單倍型分布及頻率1)

1)-表示堿基缺失.

2.3 遺傳背景

分別對亞洲和歐洲起源豬種(中國地方豬種二花臉和瑞士選育豬)[17-18]的mtDNA D-loop序列(AF276922[18]和AJ002189[19])進(jìn)行遺傳背景研究，經(jīng)核苷酸比對，根據(jù)亞洲和歐洲來源家豬mtDNA D-loop核苷酸序列存在的特征性堿基(表2)將17個(gè)單倍型分為兩個(gè)單倍類，即亞洲單倍類(Hap1-13)和歐洲單倍類(Hap14-17).中介網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析結(jié)果(圖1)表明，合作藏豬和長白豬的單倍型僅分布在亞洲單倍類，杜洛克豬和大白豬的單倍型同時(shí)出現(xiàn)在亞洲和歐洲兩個(gè)單倍類中.

圖1 4個(gè)豬群單倍型的中介網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

3 討論

3.1 遺傳多樣性的變化趨勢

Muir et al[20]研究表明：地方雞種群數(shù)量下降意味著其遺傳多樣性減少，并比較了地方雞品種和商業(yè)選育品種數(shù)千個(gè)單核苷酸多樣度的遺傳標(biāo)記，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的推移，商業(yè)選育雞品種失去了超過半數(shù)的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn).單純追求生產(chǎn)性能而開展的高強(qiáng)度選育，使核苷酸變異、等位基因或單倍型數(shù)量等降低的現(xiàn)象在豬的種質(zhì)遺傳資源方面也同樣發(fā)生.Li et al[21]采用微衛(wèi)星對中國4個(gè)地方豬種和一個(gè)澳大利亞選育豬種遺傳多樣性的研究中發(fā)現(xiàn)，澳大利亞選育豬種的等位基因數(shù)最少.本試驗(yàn)結(jié)果表明，合作藏豬和長白豬的核苷酸變異系數(shù)、核苷酸多樣度和平均核苷酸變異系數(shù)等遺傳多樣性指標(biāo)低于杜洛克和大白兩個(gè)選育豬種.盡管杜洛克豬和大白豬經(jīng)歷了高強(qiáng)度選育，然而在選育過程中，由于這兩個(gè)豬種分別來自亞洲和歐洲兩個(gè)母系，其遺傳背景較合作藏豬和長白豬復(fù)雜，表現(xiàn)出了相對較高的核苷酸多樣度及其變異系數(shù).由于外來豬種的大量飼養(yǎng)，合作藏豬當(dāng)前的分布區(qū)域、飼養(yǎng)量逐漸萎縮，且由于其繁殖周期長、產(chǎn)仔數(shù)低(5-6頭)[22]，導(dǎo)致核苷酸的變異速率相對較慢，最終表現(xiàn)為遺傳資源呈現(xiàn)下降趨勢.與此相反，應(yīng)用現(xiàn)代育種技術(shù)選育的豬種，其繁殖周期短且產(chǎn)仔數(shù)高(10頭以上)[22]，在較高的繁殖率條件下，核苷酸發(fā)生變異的速率加快.

盡管選育豬種的高繁殖力與核苷酸變異速率的加快有關(guān)，然而對單倍型的分析發(fā)現(xiàn)，合作藏豬的單倍型數(shù)(12個(gè))、單倍型比例(0.203)和單倍型多樣度(0.904)均高于3個(gè)選育豬種，這從分子遺傳標(biāo)記上印證了工業(yè)化豬生產(chǎn)中，選育豬種以極少的種用母豬生產(chǎn)大量仔豬的現(xiàn)象，其母系逐漸趨向于單一化，而處于自然繁殖狀態(tài)下的合作藏豬保持了相對豐富的母系遺傳多樣性.

3.2 合作藏豬的遺傳資源及其母系背景

地方畜禽在長期進(jìn)化過程中形成了豐富的遺傳資源寶庫，在環(huán)境適應(yīng)性和抗病性等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，但由于不能滿足當(dāng)前人們對經(jīng)濟(jì)利益的單純追求，受到具有較高經(jīng)濟(jì)效益的選育品種的排擠(被外來品種取代或與外來品種雜交)，導(dǎo)致地方畜禽遺傳資源面臨瀕危，甚至滅絕.由此來看，選育豬種和地方豬種因高強(qiáng)度選育、種群數(shù)量下降及生態(tài)環(huán)境改變，導(dǎo)致了其遺傳多樣性下降，表現(xiàn)出與家雞類似的結(jié)果[20]，即抗逆性下降，使人類在應(yīng)對大氣變化和惡性動(dòng)物疾病等突發(fā)事件方面難以應(yīng)對.本試驗(yàn)研究合作藏豬及引入豬種的遺傳多樣性現(xiàn)狀及分布規(guī)律，旨在為資源保護(hù)提供參考依據(jù).

單倍型多樣度和核苷酸多樣度是衡量一個(gè)群體mtDNA 變異程度的兩個(gè)重要指標(biāo)[23]，但各有側(cè)重.單倍型多樣度可以反映群體母系遺傳背景的豐富程度，而核苷酸多樣度則反映了群體內(nèi)個(gè)體間的變異.本試驗(yàn)研究的合作藏豬和3個(gè)引入豬種中，單倍型多樣度以合作藏豬最高.中介網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析表明，合作藏豬單倍型均分布在亞洲來源的單倍型中，各單倍型形成的星狀結(jié)構(gòu)表明其已形成穩(wěn)定的種群.合作藏豬以放養(yǎng)為主的飼養(yǎng)方式，繁育受人為干預(yù)較少，表現(xiàn)出自然交配后的種群分化結(jié)果，即在長期的自然馴化過程中形成了種群擴(kuò)張.歐洲單倍類型中沒有發(fā)現(xiàn)合作藏豬，說明歐洲起源豬種沒有入侵到其母系群體中.杜洛克豬和大白豬同時(shí)具備歐洲和亞洲家豬單倍型，說明其在人工選育的過程中參入了亞洲和歐洲家豬的母系血統(tǒng)，高頻率(58)的單倍型Hap1正是人為干預(yù)下單一母系高效率繁殖的結(jié)果.因此，從遺傳資源保護(hù)的角度來看，應(yīng)盡可能保持地方豬種的自然繁殖方式，降低人工選育強(qiáng)度.

[1] 李金元,羅章.西藏高原藏豬生活習(xí)性的調(diào)查研究[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào),1993,14(1)：18-21.

[2] 張牧,戴伯章.胎次和妊娠期對母豬產(chǎn)仔數(shù)和仔豬增重的影響[J].江蘇農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),1996,17(2):33-34.

[3] 周志強(qiáng),金敏球,肖新良,等.長白母豬斷奶至配種間隔時(shí)間與下一產(chǎn)的產(chǎn)仔數(shù)之關(guān)系[J].養(yǎng)豬,2002(2):16.

[4] 呼紅梅,郭建鳳,朱榮生,等.胎次對杜洛克和大約克母豬繁殖性能影響的研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2008(3):31-33.

[5] 呂學(xué)斌,鄒方東,趙森林,等.藏豬種質(zhì)資源細(xì)胞遺傳學(xué)研究[J].四川動(dòng)物,2009,28(6):831-834.

[6] 楊會(huì)強(qiáng).藏豬β-珠蛋白基因與其低氧遺傳適應(yīng)的關(guān)系[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2010.

[7] 楊濤.藏豬MHC-DQB1基因多態(tài)性的研究[D].拉薩:西藏大學(xué),2010.

[8] 朱礪.豬骨骼肌形成過程中的幾種決定因子(MDF)的遺傳效應(yīng)及其遺傳多態(tài)性和分子進(jìn)化研究[D].雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2004.

[9] ZHANG S Q, XU J C, ZHANG Y P, et al. Genetic diversity of Zhejiang native pig breeds inferred from mitochondrial DNA polymorphism [J]. Zool Res, 1998,19(2):125-130.

[10] LIU Z L, WEI H, ZENG Y Z, et al. Analysis of the porcine mtDNA D-loop PCR RFLP [J]. Shanghai Lab Anim Sci, 2000,20(1):7-10.

[11] GROSSI S F, LUI J F, GARCIA J E, et al. Genetic diversity in wild (Susscrofascrofa) and domestic (Susscrofadomestica) pigs and their hybrids based on polymorphism of a fragment of the D-loop region in the mitochondrial DNA [J]. Gene Mol Res, 2006,5(4):564-568.

[12] JIAO T, ZHAO S G, WANG C, et al. Mitochondrial DNA D-loop diversity of Tibetan Pig populations [J]. Philippine Agriculture Scientist, 2009,92(4):362-369.

[13] LI J, YANG H, LI J R, et al. Artificial selection of the melanocortin receptor 1 gene in Chinese domestic pigs during domestication [J]. Heredity, 2010,105(3):274-281.

[14] SAMBROOK J, RUSSELL D. Molecular cloning: a laboratory manual[M]. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2002:484-485.

[15] YANG J, WANG J, KIJAS J, et al. Genetic diversity present within the near-complete mtDNA genome of 17 breeds of indigenous Chinese pigs [J]. Journal of Heredity, 2003,94(5):381-385.

[16] TAMURA K, DUDLEY J, NEI M. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0 [J]. Mol Biol Evol, 2007,24:1596-1599.

[17] GONGORA J, FLEMING P, SPENCER P B, et al. Phylogenetic relationships of Australian and New Zealand feral pigs assessed by mitochondrial control region sequence and nuclear GPIP genotype [J]. Mol Phylogenet Evol, 2004,33(2):339-348.

[18] KIM K I, LEE J H, LI K, et al. Phylogenetic relationships of Asian and European pig breeds determined by mitochondrial DNA D-loop sequence polymorphism [J]. Animal Genetics, 2002,33:19-25.

[19] URSING B M, ARNASON U. The complete Mitochondrial DNA sequence of the pig (Susscrofa) [J]. J Mol Evol, 1998,47:302-306.

[20] MUIR W M, WONG G K, ZHANG Y, et al. Genome-wide assessment of worldwide chicken SNP genetic diversity indicates significant absence of rare alleles in commercial breeds. [J]. PNAs, 2008,105(45):17312-17313.

[21] LI K, CHEN Y, MORAN C, et al. Analysis of diversity and genetic relationships between four Chinese indigenous pig breeds and one Australian commercial pig breed [J]. Animal Genetics, 2000,31:322-325.

[22] 楊公社.豬生產(chǎn)學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2012.

[23] SBISA E, TANZARIELLO F, REYES A, et al. Mammalian mitochondrial D-loop region structural analysis: identification of new conserved sequences and their functional and evolutionary implications [J]. Gene, 1997,205(12):125-140.

(責(zé)任編輯:施曉棠)

Genetic diversity of commercial pigs and Hezuo Tibetan pig

ZHAO Sheng-guo1， LIU Li-xia2, ZHEN Wang-shan1, QUAN Jin-qiang1, WANG Wen-qiang1,GUO Yong-bo1, LI Yong-qing1, JIAO Ting3, CAI Yuan1

(1.College of Animal Science and Technology, Gansu Agriculture University, Lanzhou, Gansu 730070, China; 2.College of Life Science and Engineering, Northwest University for Nationalities, Lanzhou, Gansu 730030, China; 3.College of Grassland Sciences, Gansu Agriculture University, Lanzhou, Gansu 730070, China)

The mitochondrial DNA D-loop (mtDNA D-loop) sequences of 178 individuals obtained from Duroc pig, Large White pig, Landrace pig and Hezuo Tibetan pigs were sequenced and analyzed to assess the effect of imported breed on genetic resource of Hezuo Tibetan pigs. The nucleotide diversity and average number of nucleotide differences of Hezuo Tibetan pigs were lower than that of Duroc pigs and Large White pigs, and higher than that of Landrace pigs. The haplotype diversity of Hezuo Tibetan pigs was higher than that of the three imported pig breeds. The analysis of haplotypes indicated that Hezuo Tibetan pigs were droped in the clade of Asia, both of Asia and Europe clades had been found in Duroc pigs and Large White pig presented, which implied maternal of Hezuo Tibeatan pigs had not eroded by commercial pigs originated from Europe.

Hezuo Tibetan pig; mtDNA D-loop; haplotype; genetic diversity

2014-07-03

2014-09-13

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)盛彤笙科技創(chuàng)新項(xiàng)目(GSAU-STS-1236).

趙生國(1976-)，男，副教授.研究方向:動(dòng)物遺傳學(xué).Email:zhaosg@gsau.edu.cn.通訊作者蔡原(1974-)，女，副教授.研究方向:動(dòng)物遺傳學(xué).Email:caiyuan@gsau.edu.cn.

S813.1

A

1671-5470(2015)04-0391-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.04.010