應用多重PCR檢測煙草黑脛病菌、根黑腐病菌、猝倒病菌及立枯病菌

劉萍花, 方敦煌, 吳祖建

(1.福建農(nóng)林大學植物病毒研究所，福建 福州 350002；2.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院，云南 玉溪 653100)

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應用多重PCR檢測煙草黑脛病菌、根黑腐病菌、猝倒病菌及立枯病菌

劉萍花1, 方敦煌2, 吳祖建1

(1.福建農(nóng)林大學植物病毒研究所，福建 福州 350002；2.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院，云南 玉溪 653100)

通過篩選特異性引物，優(yōu)化多重PCR體系中的Mg2+、dNTP Mixture、TaqDNA聚合酶濃度，退火溫度等反應條件，建立了多重PCR同時檢測4種病菌(煙草黑脛病菌、根黑腐病菌、猝倒病菌和立枯病菌)的技術(shù)體系，得到265、364、400和541 bp共4條特異性條帶，對應的病菌分別為猝倒病菌、黑脛病菌、根黑腐病菌、立枯病菌.該檢測體系的靈敏度可達10-2ng·μL-1基因組DNA.

煙草; 煙草黑脛病菌; 根黑腐病菌; 猝倒病菌; 立枯病菌; 多重PCR

煙草是重要的經(jīng)濟作物之一，隨著該產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，煙草病害危害逐年加重.其中，煙草黑脛病、根黑腐病、猝倒病和立枯病等是煙草上最主要的土傳病害，這些病菌相互作用，復合侵染，加劇了對煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量的影響[1].對于煙草病菌的檢測，傳統(tǒng)方法主要采用對典型癥狀的病樣進行分離、鑒定，其耗時長，靈敏度低，易受人為及環(huán)境等諸多因素的干擾[2].因此，煙草生產(chǎn)上迫切需要一種能在發(fā)病初期或土壤中進行快速診斷的技術(shù).

多重PCR(polymerase chain reaction)是在普通PCR基礎(chǔ)上加以改進，在一個PCR 反應體系中加入多對特異性引物，針對多個DNA 模板或同一模板的不同區(qū)域擴增多個目的片段的技術(shù)[3]，已應用于基因診斷和病原微生物的診斷和鑒定.謝燕婷等[4]建立了豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型與豬細小病毒的多重PCR檢測體系；鄭軒等[5]應用多重PCR技術(shù)實現(xiàn)了對5種煙草病毒病的檢測；張麗芳等[6]應用多重PCR技術(shù)建立了煙草青枯病、黑脛病及猝倒病3種病菌的同步檢測.但有關(guān)煙草黑脛病、根黑腐病、猝倒病和立枯病等病菌的多重PCR檢測尚未見報道.為此，本研究通過篩選合適的引物，優(yōu)化多重PCR反應體系的條件參數(shù)，建立一套同時檢測煙草黑脛病菌(hytophthoranicotianae)、根黑腐病菌(Thielavioisbasicola)、猝倒病菌(Pythiumphanidermatum)和立枯病菌(Rhizoctoniasolani)的多重PCR反應體系，為煙草病菌的監(jiān)測、病害的診斷和防控提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 供試的煙草黑脛病菌、根黑腐病菌、猝倒病菌和立枯病菌菌株均由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院實驗室分離保存.

1.1.2 病株樣本 采集云南省玉溪市植煙區(qū)病株疑似樣本20份.

1.2 菌絲體的收集及基因組DNA的提取

將供試煙草黑脛病菌和猝倒病菌的菌株移至OA固體培養(yǎng)基平板上，根黑腐病菌和立枯病菌的菌株移至PDA平板上，28 ℃黑暗培養(yǎng)3 d后在菌落邊緣切取小菌落塊，然后將根黑腐病菌和立枯病菌的菌株移至PDB培養(yǎng)基中，其他菌株移至番茄汁液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d，過濾收集菌絲.所有供試菌株基因組DNA均采用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒(購自上海生工生物工程有限公司)提取.

1.3 引物的設(shè)計與篩選

根據(jù)立枯絲核菌的保守區(qū)(GenBank登錄號為JQ313811.1)，應用Primer 5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計一對特異性引物RsF/RsR，根黑腐病菌采用特異性引物TBF/TBR[7]、煙草黑脛病菌和猝倒病菌采用張麗芳等[6]設(shè)計的特異性引物.引物由寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)合成，引物序列見表1.

表1 用于多重PCR擴增的特異性引物

1.4 多重PCR檢測方法的建立及條件優(yōu)化

1.4.1 單項PCR檢測 分別以4種供試病原菌的DNA為模板，用相應的引物進行單項PCR擴增.PCR反應體系(25 μL)：TaKaRa LaTaq酶(5 U·μL-1) 0.2 μL，10×LA PCR Buffer Ⅱ (Mg2+Free) 2.5 μL，MgCl2(25 mmol·L-1) 2.5 μL，dNTP Mixture (2.5 mmol·L-1) 4.0 μL，上、下游引物(20 μmol·L-1)各0.5 μL，DNA模板1.0 μL，添加ddH2O至25 μL.反應條件：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性40 s，59 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，30 個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min.取10 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析比較.

1.4.2 多重PCR反應條件的優(yōu)化 根據(jù)多次重復試驗和經(jīng)驗，以及查閱文獻[8]發(fā)現(xiàn)，影響多重PCR反應結(jié)果的因素主要為退火溫度，以及dNTP Mixure、Mg2+和TaqDNA聚合酶濃度等.因此，本試驗將主要對這些反應條件進行優(yōu)化，進而確定多重PCR擴增的最佳反應體系和程序.

(1)Mg2+(25 mmol·L-1)添加量:在其他條件不變的情況下，將25 μL體系中Mg2+的添加量分別設(shè)2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 μL等6個處理.

(2)dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1)添加量:在其他條件不變的情況下，將25 μL體系中dNTPs的添加量分別設(shè)2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 μL等6個處理.

(3)LaTaq酶(5 U·μL-1)添加量:在其他條件不變的情況下，將25 μL體系中LaTaq酶的添加量分別設(shè)0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 μL等6個處理.

(4)退火溫度:在多重PCR反應體系中，將退火溫度按照1 ℃梯度設(shè)定為53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64 ℃.

1.4.3 多重PCR反應特異性檢測 以煙草黑脛病菌、根黑腐病菌、猝倒病菌和立枯病菌的基因組DNA隨機等量組合作為模板，用優(yōu)化后的反應體系進行擴增，驗證多重PCR反應的特異性.

1.4.4 多重PCR反應靈敏度檢測 經(jīng)超微量分光光度計測定煙草黑脛病菌、猝倒病菌、根黑腐病菌和立枯病菌的DNA模板濃度，從初始濃度開始依次按100-105梯度進行倍比稀釋.按照已經(jīng)優(yōu)化的多重PCR條件進行擴增，測定多重PCR的靈敏度.

1.5 多重PCR檢測方法的初步應用

在烤煙生長期的6-7月，從玉溪植煙區(qū)采集疑似病株樣本，用自來水洗凈染病根莖部，取病健交界處組織，切成4 mm2小塊，用70%酒精消毒30 s后，取其200-300 mg按Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒(購自上海生工生物工程有限公司)的方法提取樣品DNA.利用同樣的方法提取健康組織樣品中的DNA.以提取的健康組織樣品DNA為模板，煙草黑脛病、猝倒病、根黑腐病和立枯病病原物DNA為陽性對照，無菌水DNA為陰性對照，采用建立的多重PCR反應體系進行電泳鑒定.

2 結(jié)果與分析

2.1 單項PCR電泳檢測結(jié)果

以煙草黑脛病菌、猝倒病菌、根黑腐病菌和立枯病菌DNA作為模板，經(jīng)PCR擴增分別得到265、364、400和541 bp的特異性條帶(圖1).

2.2 多重PCR檢測方法的建立及條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 最適Mg2+(25 mmol·L-1)添加量的選擇 在四重PCR體系中，當Mg2+添加量為2.0-4.5 μL時均可擴增出4條條帶，其中添加量為4.0 μL時，4條目的條帶均較為清晰(圖2).因此，本試驗最終選擇4.0 μL作為最適Mg2+添加量.

M.250 bp DNA Marker；1.猝倒病菌；2.黑脛病菌；3.根黑腐病菌；4.立枯病菌.

2.2.2 最適dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1)添加量的選擇 如圖3所示，當dNTP Mixture添加量為4.0、4.5、5.0 μL時，均能擴增出清晰的4條特異性條帶，而當dNTP Mixture添加量小于4.0 μL時，只能擴增出部分條帶.綜合各因素考慮，本試驗將4.5 μL確定為最適dNTP Mixture添加量.

M.250 bp DNA Marker；1-6.dNTPs添加量分別為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 μL；7.陰性對照.

2.2.3 最適LaTaq酶(5 U·μL-1)添加量的選擇 如圖4所示，當LaTaq酶的添加量為0.20-0.45 μL時，均能擴增出4條清晰的特異性條帶.其中，當LaTaq酶添加量為0.20 μL時，就有非常清晰的4條目的條帶，并且拖尾現(xiàn)象較弱.因此，本試驗將0.20 μL確定為最適LaTaq酶添加量.

M.250 bp DNA Marker；1-6.La Taq酶的添加量分別為0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 μL；7.陰性對照.

2.2.4 最適退火溫度的選擇 從圖5可以看出，1-12泳道均出現(xiàn)了4條目的條帶，說明在53-64 ℃下均能進行PCR反應.但當退火溫度為56 ℃時，4條目的條帶較為均一，所以本試驗將其定為最適退火溫度.

M.250 bp DNA Marker;1-12分別為53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64 ℃.

2.2.5 多重PCR反應的特異性和靈敏度 如圖6所示，該多重PCR檢測體系具有較好的穩(wěn)定性，說明其反應特異性較強.此外，本研究測得煙草黑脛病菌、猝倒病菌、根黑腐病菌和立枯病菌DNA模板的濃度分別為227、179、190和254 ng·μL-1.倍比稀釋擴增結(jié)果如圖7所示，同時檢測4種病菌的靈敏度可達到10-2ng·μL-1基因組DNA.

M.250 bp DNA Marker；1.猝倒病菌和根黑腐病菌；2.猝倒病菌和立枯病菌；3、7.黑脛病菌和根黑腐病菌；4.黑脛病菌和立枯病菌；

M.DL2000 DNA Marker；1-6.模板依次稀釋100-105倍后的擴增結(jié)果.

2.3 多重PCR檢測方法的初步應用

取樣測定結(jié)果表明，4個陽性對照均呈現(xiàn)相應的特異性條帶;陰性對照、健康組織樣品均無擴增;20個疑似病株樣品中有16個擴增出364 bp的特異條帶,2個擴增出400 bp的特異條帶,1個擴增出265 bp的特異條帶,1個擴增出364和400 bp的特異條帶.這些結(jié)果表明，所采集的疑似病株樣本中以煙草黑脛病為主，根黑腐病、猝倒病偶見，極個別存在煙草黑脛病、根黑腐病復合侵染現(xiàn)象，未見立枯病.

3 討論

多重PCR具有檢測時間短、試驗成本低以及快速、高通量等優(yōu)點，廣泛應用于病菌的檢測.但是，多重PCR要求在同一反應體系中進行多個位點的特異性擴增，因而技術(shù)難度較大.在多重PCR反應體系中，引物至關(guān)重要，合適的引物既能增加多重PCR的特異性，又能增加其敏感性[9].真菌的rDNA-ITS序列是中度重復序列，廣泛分布于基因組，國內(nèi)外已有利用真菌rDNA-ITS區(qū)域在科、屬、種水平上的差異，設(shè)計特異性引物，進行植物病害診斷和病菌檢測的報道[10-11].本研究中檢測引物的設(shè)計也是基于此.

靈敏度是評價多重PCR反應的重要指標之一.本試驗通過對多重PCR反應條件的優(yōu)化，同時檢測煙草黑脛病菌、猝倒病菌、根黑腐病菌和立枯病菌的靈敏度可達10-2ng·μL-1基因組DNA.

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(責任編輯:楊郁霞)

Simultaneous detection ofPhytophthoranicotianae,Thielavioisbasicola,PythiumaphanidermatumandRhizoctoniasolaniinfected tobacco by multiplex PCR

LIU Ping-hua1, FANG Dun-huang2, WU Zu-jian1

(1.Institute of Plant Virology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China;2.Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences, Kunming, Yunnan 653100, China)

Four pairs of specific primers were designed according to rDNA-ITS of the four pathogensPhytophthoranicotianae(Pn),Thielavioisbasicola(Tb),Pythiumaphanidermatum(Pa) andRhizoctoniasolani(Rs). Specific fragments of 265 bp (Pa), 364 bp (Pn), 400 bp (Tb) and 541 bp (Rs) were successfully amplified by the multiplex PCR system based on the optimization of the concentration of Mg2+, dNTP Mixture,TaqDNA polymerase, and the annealing temperature. The detection sensitivity of four pathogens was nearly 10-2ng·μL-1DNA.

tobacco;Phytophthoranicotianae;Thielavioisbasicola;Pythiumaphanidermatum;Rhizoctoniasolani; multiplex PCR

2014-09-25

2014-12-22

中國煙草總公司云南省公司科技計劃項目(2012YN05).

劉萍花(1990-)，女，碩士研究生.研究方向：煙草真菌病害.通訊作者方敦煌(1967-)，男，副研究員，博士.研究方向：煙草病害及其防治.Email：fdhkm@sina.com.

S435.72

A

1671-5470(2015)04-0345-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.04.002