基于ITS序列的梅花草屬Parnassia L.系統(tǒng)發(fā)育初步研究

柏夢(mèng)焱，李亞茹，朱瓊潔，葉成超，劉碩然

（大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003）

梅花草屬ParnassiaLinnaeus，1753根據(jù)P.palustris建立，是一類多年生草本植物，分布于北溫帶，主要分布于東亞和北美，極少數(shù)分布到歐洲及其他地區(qū)〔1-3〕。根據(jù)谷粹芝〔2〕、Gu和 Hultg?rd〔4〕的研究，中國分布有63種，其中49種為特有種，且集中分布于我國的西南部山區(qū)，該區(qū)是梅花草屬的現(xiàn)代分布中心和分化中心。

梅花草屬建立至今已有200多年的研究歷史。長期以來該屬的分類地位及其分類系統(tǒng)一直處于爭議狀態(tài)。根據(jù)形態(tài)學(xué)的研究，梅花草屬處于一個(gè)難以確定的系統(tǒng)位置，系統(tǒng)分類差異大，或作為虎耳草科Saxifragaceae的一個(gè)亞科，即梅花草亞科Parnassioideae；或獨(dú)立成一科，即梅花草科Parnassiaceae〔1，5-8〕。近幾年來隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，特別是PCR技術(shù)的運(yùn)用及DNA測(cè)序方法的改進(jìn)，大量分子序列數(shù)據(jù)的不斷累積，越來越多的基因片段被獲得并應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育的研究。特別是被子植物大系統(tǒng)的建立，關(guān)于梅花草屬的系統(tǒng)位置的觀點(diǎn)也趨于一致。Soltis等基于rbcL序列對(duì)廣義虎耳草科Saxifragaceae的研究表明梅花草屬與伯力木屬Brexia關(guān)系密切〔9〕；Savolainen等基于atpB-rbcL序列片段的研究認(rèn)為梅花草屬與衛(wèi)矛科Celastraceae、翅子藤科Hippocrateaceae和伯力木屬構(gòu)成姊妹群〔10〕。APG的研究表明梅花草科包括梅花草屬和微型草屬Lepuropetalon兩屬，本科的系統(tǒng)關(guān)系與虎耳草科相距甚遠(yuǎn)，而與衛(wèi)矛科構(gòu)成姊妹群，同屬于衛(wèi)矛目〔11-12〕。顯然，分子系統(tǒng)學(xué)研究與以往主要根據(jù)形態(tài)學(xué)研究的結(jié)果有很大的差異?！吨袊参镏尽芬约拔鞑?、四川、內(nèi)蒙古、青海、秦嶺等各地方植物志的完成，使該屬及屬下分類單元的劃分和系統(tǒng)演化更為清晰。2005年吳丁對(duì)梅花草屬的分類系統(tǒng)學(xué)進(jìn)行了詳細(xì)的研究，并提出了一個(gè)將梅花草屬植物劃分為12組的系統(tǒng)框架〔13〕，但是其在分類過程中，并不是所有的梅花草屬植物都運(yùn)用了分子分析的手段。

在屬下、種間等系統(tǒng)學(xué)研究中，由于ITS片段具有引物通用、片段長短適中等特點(diǎn)，因此已得到廣泛應(yīng)用〔14-15〕，同時(shí)Yang等〔16〕在2011年利用DNA條碼技術(shù)鑒別梅花草屬物種的研究中，表明在單序列分析中ITS片段具有最高的準(zhǔn)確性，達(dá)86.7%；在多序列組合分析中，ITS+trnH-psbA序列片段具有最高準(zhǔn)確性，達(dá)90%；因此，本研究將利用梅花草屬植物的ITS序列，通過三種不同的方法對(duì)所構(gòu)建的發(fā)育樹之間的差異進(jìn)行比較分析，并結(jié)合吳丁所創(chuàng)建的梅花草屬植物的現(xiàn)代屬下分類系統(tǒng)，補(bǔ)充分析未采用分子手段進(jìn)行分類的幾個(gè)物種，使這個(gè)分類系統(tǒng)更具權(quán)威性，種間關(guān)系更加清晰，為梅花草屬植物系統(tǒng)進(jìn)化及相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究材料來源 研究所用的梅花草屬rDNAITS序列片段來源于NCBI網(wǎng)站（National Center for Biotechnology Information）。共收集到30條，包括ITS1、5.8S和ITS2，片段總長度661 bp，由于微型草Lepuropetalon spathulatum與內(nèi)類群趨異率較小，且與其他外群相比具有最好的同源性，因此選擇微型草作為外群。

1.2 序列編輯及分析 首先序列矩陣上傳至MUSCLE（Multiple Sequence Comparison by Log-Expectation）進(jìn)行排序〔17〕，再運(yùn)用Bioedit7.0.9.0將排序后的矩陣手動(dòng)完善序列〔18〕。

1.2.1 鄰接法 序列分析采用軟件MEGA5.1，依據(jù)最大復(fù)合可能性原則，分枝的可靠性評(píng)價(jià)使用Bootstrap分析啟發(fā)性搜索，1 000次重復(fù)取樣，各序列矩陣中的空位和缺失作刪除處理〔19〕。

1.2.2 最大似然法 序列分析上傳至ATGC：Phy-ML生物信息學(xué)在線平臺(tái)，選用GTR為替代模型，選用SPR＆NNI來提高樹形的穩(wěn)定性，“靴帶”分析設(shè)置為100次循環(huán)，各序列矩陣中的空位和缺失作刪除處理〔20〕。

1.2.3 貝葉斯推理法 序列分析采用Mrbayes-3.1.2軟件，設(shè)置進(jìn)行1 000 000次取樣，每10代抽取一棵樹，共得到100 000棵樹，前25 000棵樹舍棄，剩余樹經(jīng)估算得到的50%主要規(guī)則一致樹及后驗(yàn)概率，取得0.004 4的分散頻率的平均方差，達(dá)到了小于0.01的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

基于上述3種構(gòu)樹方法，所得NJ樹、ML樹和BI樹如圖1、2、3所示。

圖1 根據(jù)ITS序列構(gòu)建的NJ樹

結(jié)果表明，NJ樹和ML樹的分枝的靴帶支持率整體不高，其中NJ樹少數(shù)分枝支持率達(dá)到100；ML樹少數(shù)分枝支持率達(dá)到100，最低為4，系統(tǒng)樹的中下部分枝支持率偏低。

圖2 根據(jù)ITS序列構(gòu)建的ML樹

圖3 根據(jù)ITS序列構(gòu)建的BI樹

扁平三裂組Sect.nectarotrilobos的凹瓣梅花草P.mysorensis、近凹瓣梅花草P.submysorensis、高山梅花草P.cacuminum、中國梅花草P.chinensis、無斑梅花草P.epunctulata、妖媚梅花草P.venusta、康定梅花草P.kangdingensis、類三脈梅花草P.pusilla和柱形組Sect.saxifragastrum的云南梅花草P.yunnanensis8個(gè)種均位于樹的頂端，在BI樹的靴帶支持率均在96%以上，而在NJ樹和ML樹上的分枝支持率不高。

扁平五裂組Sect.allolobos的寬葉梅花草P.dilatata、厚葉梅花草P.perciliata、雞肫梅花草P.wightiana、桂林梅花草P.guilinensis4個(gè)種和長藥隔組Sect.xiphosandra的突隔梅花草P.delavayi、細(xì)裂梅花草P.leptophylla、短柱梅花草P.brevistyla3種構(gòu)成姐妹群，且在BI樹的靴帶支持率達(dá)100%，但在NJ樹和ML樹上的分枝支持率不高。

外群微型草均處于系統(tǒng)樹的基部，長葉組Sect.longiloba的長枝梅花草P.grandifolia、灰梅花草P.glanca、細(xì)辛葉梅花草P.asarifola3個(gè)種均處于系統(tǒng)樹的亞基部，在BI樹的靴帶支持率達(dá)99%，但在NJ樹和ML樹上的分枝支持率不高。

現(xiàn)代梅花草屬植物的分類系統(tǒng)由吳丁在2005年建立，在建立此分類系統(tǒng)的過程中，采用了分子分析的手段，但是并沒將所有的物種囊括其中，在本文研究的30個(gè)梅花草物種中，有11個(gè)物種不在其梅花草屬屬下分類系統(tǒng)時(shí)所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，如表1所示?；?種不同構(gòu)樹方法的比較研究，BI樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)較好的表現(xiàn)出了梅花草屬植物的親緣關(guān)系，因此本文依據(jù)此11個(gè)物種在BI樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（如圖3）所處位置和現(xiàn)代分類系統(tǒng)所處位置進(jìn)行比較分析。

從BI樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)來看，長葉組的云梅花草和無葉組的黃花梅花草構(gòu)成一支，但是靴帶支持率低于50%。齒裂組的格德梅花草、長爪梅花草和柱形組的長瓣梅花草構(gòu)成一個(gè)單系類群，支持率為99%，其中齒裂組的長爪梅花草和柱形組的長瓣梅花草形成一個(gè)小分枝，支持率為100%。

表1 通過系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究其分類地位的11個(gè)物種及其所屬組

由BI樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可知，長枝組的長枝梅花草、灰梅花草、細(xì)辛葉梅花草處于系統(tǒng)樹的基部，構(gòu)成一個(gè)單系類群，靴帶支持率為99%，其中長枝梅花草和灰梅花草關(guān)系更為密切，形成一小分枝，支持率為100%；梅花草組的克氏梅花草和梅花草構(gòu)成一支，形成一個(gè)單系類群，支持率為100%；長藥隔組的細(xì)裂梅花草和突隔梅花草、短柱梅花草構(gòu)成單系類群，支持率為90%，其中細(xì)裂梅花草和突隔梅花草關(guān)系更加密切，形成一小分枝，支持率為100%；扁平五裂組的寬葉梅花草和雞肫梅花草、厚葉梅花草、桂林梅花草構(gòu)成一個(gè)單系類群，支持率為99%，其中寬葉梅花草和厚葉梅花草形成一小分枝，支持率為100%。

3 討論

3.1 3種不同構(gòu)樹方法的比較分析 由鄰接法、最大似然法、貝葉斯推理法分析得到的系統(tǒng)發(fā)育樹在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上保持較高的一致性，僅在部分端、部分枝表現(xiàn)出差異。NJ樹和ML樹的靴帶支持率不高，說明NJ樹和ML樹上各組的系統(tǒng)關(guān)系可信度較低。而BI樹分枝的后驗(yàn)概率較高，大多數(shù)為100%，且基本都在95%以上，說明BI樹上各組的系統(tǒng)關(guān)系可信度較高。關(guān)于上述3種方法的適用性，基于本研究的數(shù)據(jù)貝葉斯推理法所得的系統(tǒng)發(fā)育樹獲得了最高的后驗(yàn)概率，即拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性。

對(duì)比上述三棵系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，在三棵樹中物種分布基本一致。但是其中有幾組的梅花草屬植物網(wǎng)結(jié)在一起，形成多個(gè)單枝，根據(jù)吳丁〔13〕提出的該屬可能的演化路線圖，唇形組的龍場(chǎng)梅花草更靠近基部；長葉組的云梅花草和無葉組的黃花梅花草關(guān)系密切；齒裂組、柱形組與扁平三裂組、扁平五裂組具有較近的親緣關(guān)系，對(duì)比三棵系統(tǒng)發(fā)育樹，BI樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)較好地表現(xiàn)出了梅花草屬植物的親緣關(guān)系。

3.2 分子手段對(duì)現(xiàn)代梅花草屬植物分類系統(tǒng)的論證從結(jié)果中可分析得出：齒裂組的長爪梅花草和柱形組的長瓣梅花草形成一個(gè)小分枝，支持率為100%，同時(shí)結(jié)合長瓣梅花的形態(tài)特征，其退化雄蕊不具備齒裂組的退化雄蕊扁平，低倒梯形，頂端具5～7齒的特點(diǎn)，而符合柱形組的退化雄蕊特點(diǎn)，因此長瓣梅花草仍屬于柱形組。而其他10種梅花草在BI樹上表現(xiàn)出來的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)均與梅花草屬現(xiàn)代分類系統(tǒng)一致。

3.3 梅花草屬植物的系統(tǒng)關(guān)系

3.3.1 三脈梅花草與綠花梅花草親緣關(guān)系分析在Yang等〔16〕的利用DNA條碼技術(shù)鑒定梅花草屬一文中，試圖推斷三脈梅花草可能是綠花梅花草的祖先，并通過兩者在進(jìn)化樹上的位置進(jìn)行說明，但是其樣本數(shù)量較小且樹枝穩(wěn)定性不高，并未作出明確結(jié)論。本文通過Genbank搜集綠花梅花草和三脈梅花草的ITS片段，從其所構(gòu)成的BI系統(tǒng)發(fā)育樹來看，綠花梅花草和三脈梅花草兩者同屬一枝，枝長相近，且支持率達(dá)到100%，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定。此外，本文還選取了二者ITS序列片段進(jìn)行同源性計(jì)算分析，兩者的同源性高達(dá)99.1%，ITS片段基本一致。因此通過本文采用的分子手段的分析，可以推斷三脈梅花草可能是綠花梅花草的祖先，但在形態(tài)學(xué)分類尚未作出改變前，我們?nèi)孕枰蟮姆N群樣本進(jìn)行分析以得到更穩(wěn)定可靠的分子數(shù)據(jù)，進(jìn)一步確定兩者的親緣關(guān)系。

3.3.2 類三脈梅花草與中國梅花草親緣關(guān)系分析在1941年“中國的梅花草”一文中類三脈梅花草被處理為中國梅花草的異名，但在現(xiàn)代梅花草屬下分類系統(tǒng)中將類三脈梅花草和中國梅花草同分在扁平三裂組〔13〕，以此本文試圖通過分子學(xué)手段推斷類三脈梅花草是否應(yīng)處理為中國梅花草的異名。由于在Genbank中沒有找到類三脈梅花草的ITS序列，而在2008年康定梅花草歸并入類三脈梅花草〔21〕，則用康定梅花草的ITS序列代替類三脈梅花草的ITS序列與中國梅花草的ITS片段構(gòu)建BI樹進(jìn)行分析。但在樹中發(fā)現(xiàn)兩者并沒有處于一枝，但通過中國梅花草和康定梅花草的ITS片段同源性分析結(jié)果來看，相似性達(dá)到96.7%，兩者ITS片段非常相似，兩個(gè)結(jié)果相矛盾，結(jié)合康定梅花草被歸并入類三脈梅花草時(shí)是認(rèn)為其子房位置存在連續(xù)性變異這一理由，所以只能推斷類三脈梅花草和中國梅花草具有非常相近的親緣關(guān)系，并不能證明為一個(gè)種，但本研究沒有到模式產(chǎn)地進(jìn)行調(diào)查和核對(duì)模式標(biāo)本，只能從分子角度得以論證。

3.3.3 高山梅花草與中國梅花草親緣關(guān)系分析觀察本研究所構(gòu)建的BI樹可以發(fā)現(xiàn)，中國梅花草和高山梅花草同屬一枝，支持率為100%，且枝長基本相等；并且二者ITS片段同源性相似性達(dá)到99.06%，從分子角度分析二者具有非常近的親緣關(guān)系，筆者認(rèn)為從分子學(xué)角度考慮，高山梅花草可以歸并入中國梅花草。

同時(shí)對(duì)二者的外觀形態(tài)進(jìn)行了比較，形態(tài)特征極近似，二者僅有的區(qū)別在中國梅花草花瓣呈倒卵形，瓣片近圓形，基部有密集長流蘇狀毛，退化雄蕊裂片等長；而高山梅花草花瓣呈匙形，先端圓，基部有少許短流蘇狀毛，退化雄蕊裂片不等長。

對(duì)二者地理分布進(jìn)行分析可知，中國梅花草分布于云南西北部、西藏東南部、四川、尼泊爾、不丹和緬甸；高山梅花草分布于我國青海東南部和四川西部和云南，而尚未查閱到其在國外有分布。通過在地圖上分析發(fā)現(xiàn)，兩者在國內(nèi)分布范圍基本一致而中國梅花草在國外也有分布，如圖4。結(jié)合吳丁在2005年對(duì)梅花草屬植物地理分布的研究，可以推斷二者分化中心位于喜馬拉雅-橫斷山脈，二者可能擁有共同的祖先，且分化程度不高。

圖4 中國梅花草與高山梅花草的地理分布區(qū)域圖

綜合上述分子序列、形態(tài)和地理分布對(duì)二者親緣關(guān)系的分析，可以得出二者外觀形態(tài)可能存在連續(xù)性變異，可能為一個(gè)種，需要更多其他分子片段的序列分析進(jìn)一步證實(shí)高山梅花草與中國梅花草的親緣關(guān)系。

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