6種中藥水溶性粗提物對雞源耐藥奇異變形桿菌的抑菌活性研究

6種中藥水溶性粗提物對雞源耐藥奇異變形桿菌的抑菌活性研究

韓鐫竹1，李欣南1，周鐵2，寧宜寶3
（1.遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，遼寧沈陽110016；2.鐵嶺市獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測站，遼寧鐵嶺112099；3.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京海淀100081）

對獲得的91株雞源奇異變形桿菌進(jìn)行了11種抗生素敏感性測定，從中篩選出5株耐藥性較高的耐藥奇異變形桿菌。以奇異變形桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為模型，進(jìn)行了31種中藥水溶性粗提物抑菌活性研究。以慶大霉素和青霉素為參照，采用管碟法對6種中藥水溶性粗提物的抑菌活性進(jìn)行效價估算。最終將6種中藥水溶性粗提物作用于篩選出的耐藥奇異變形桿菌，驗(yàn)證其抑菌活性。結(jié)果表明，31種中藥中地榆、虎杖、大黃、黃芩、大青葉和綿馬貫眾對奇異變形桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌效果最佳，對耐藥奇異變形桿菌抑菌效果明顯優(yōu)于試驗(yàn)的11種抗生素。

耐藥；奇異變形桿菌；中藥；抑菌活性

奇異變形桿菌（Proteusmirabilis，PM）屬于腸桿菌科變形桿菌屬，革蘭陰性菌，是人和動物的寄生菌和病原菌［1-2］。污染了奇異變形桿菌的肉類不論生熟常能引起人的食物中毒［3］，同時奇異變形桿菌又是一種尿路病原體［4-5］，引起的泌尿系統(tǒng)感染會使病情復(fù)雜化。而抗生素對產(chǎn)生了耐藥性的奇異變形桿菌卻是毫無辦法［6-8］，只能任由其發(fā)展。中藥藥源廣泛，毒副作用小，已在預(yù)防和治療人畜疾病方面發(fā)揮了巨大的作用［9-11］。為獲得臨床治療奇異變形桿菌相關(guān)疾病更有效的藥物，本試驗(yàn)采用奇異變形桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行31種中藥水溶性粗提物抑菌活性研究，對篩選出的具有抑菌活性的中藥水溶性粗提物進(jìn)行了當(dāng)量效價測定，并以篩選出的表型耐藥奇異變形桿菌進(jìn)行活性驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 菌株來源質(zhì)控菌株有大腸埃希菌ATCC25922、奇異變形桿菌ATCC25933、短小芽孢桿菌CMCC（B）63202、藤黃微球菌CMCC（B）28001，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；試驗(yàn)菌株于某肉雞養(yǎng)殖場分離獲得。1.2儀器生物安全柜CLASSⅡ（美國NUAIRE公司）；全自動高壓滅菌器（日本三洋電器集團(tuán)）；N-EVAP112氮吹儀（美國ORGANOMATION公司）；鋼管；玻璃平皿。

1.3 培養(yǎng)基與材料抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ號、抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅰ號、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基等，均購自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；APINaCl 0.85%培養(yǎng)基、ID32E鑒定條，均購自BIOMERIEUX公司；奇異變形桿菌藥敏檢測板，購自天津市金章科技發(fā)展有限公司；陳皮、苦參、柴胡、菟絲子、黃芪、香附、羌活、甘草、川芎、地榆、虎杖、肉蓯蓉、四葉參、起陽石、丁香、當(dāng)歸、秦艽、柴柏、枳殼、白芍、白頭翁、大黃、黨參、板藍(lán)根、鎖陽、石見穿、綿馬貫眾、大青葉、白硇砂、梔子及黃芩31種中藥飲片，購自藥房；青霉素、慶大霉素，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.4 方法

1.4.1 微量稀釋法藥敏試驗(yàn)采用美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards In?stitute，CLSI）規(guī)定的微量稀釋法進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，具體過程參考文獻(xiàn)［12-13］。

1.4.2 中藥有效成分提取及藥敏板制備取31種中藥飲片各30 g于100 mL水中，超聲60min，震蕩過夜，沸水浴煮30 min，10 000 r/min離心30 min，取上清，氮吹濃縮至5 mL，制備成中藥水溶性粗提物濃縮液。將該濃縮液稀釋成1.0 g/mL后加入96孔板中，進(jìn)行倍比稀釋，使每一排的藥物濃度為前排的1/2，終濃度為1/128 g/m L，風(fēng)干備用。

1.4.3 中藥水溶性粗提物當(dāng)量效價測定用pH值7.0磷酸鹽緩沖液分別洗下短小芽孢桿菌和藤黃微球菌斜面培養(yǎng)后的菌苔，配成終濃度分別為2.0×107CFU/m L和3.0×108CFU/m L的菌懸液。按照抗生素對應(yīng)的效價計(jì)算后分別稱取0.0070 g青霉素鈉和0.0157 g慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品于100mL容量瓶中配成儲備液。再用磷酸鹽緩沖液將中藥水溶性粗提物濃縮液和抗生素標(biāo)準(zhǔn)品儲備液稀釋到合適濃度，使抑菌圈直徑大小在20 mm±2mm范圍內(nèi)。具體方法參見《中國獸藥典》［14］。

1.4.4 中藥水溶性粗提物抑菌活性驗(yàn)證以篩選出的表型耐藥奇異變形桿菌為研究對象，采用微量稀釋法和管碟法，對6種中藥水溶性粗提物抑菌活性進(jìn)行驗(yàn)證。管碟法和微量稀釋法中奇異變形桿菌終濃度分別為5.0×106CFU/mL和1.0× 106CFU/mL，慶大霉素和青霉素的工作濃度分別為16μg/mL和64μg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型耐藥奇異變形桿菌篩選對分離鑒定得到的91株奇異變形桿菌，進(jìn)行了氨芐西林、慶大霉素等11種抗菌藥物敏感性測定。并進(jìn)行了多重抗生素耐藥性分析，從中篩選出5株耐藥表型最強(qiáng)的菌株作為試驗(yàn)菌株進(jìn)行中藥抑菌活性篩選。5株表型耐藥奇異變形桿菌對氨芐西林、慶大霉素、四環(huán)素、大觀霉素、氟苯尼考、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明、多西環(huán)素和恩諾沙星9種抗生素的抑菌濃度分別為≥32μg/mL（R）、≥16μg/mL（R）、≥16μg/mL（R）、≥256μg/mL（R）、≥16μg/mL（R）、≥512μg/mL（R）、≥4/76μg/mL（R）、32μg/ mL（R）和≥2μg/mL（I）。對敏感的抗生素頭孢噻呋和粘桿菌素的抑菌濃度為≥8μg/mL（S）和≥2 μg/mL（S）。

2.2 中藥水溶性粗提物抑菌活性篩選選取31種中藥對奇異變形桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行抑菌活性篩選，陳皮、羌活、地榆、虎杖、肉蓯蓉、柴胡、大黃、黃芩、當(dāng)歸、枳殼、鎖陽、綿馬貫眾、大青葉、白硇砂和梔子15種中藥水溶性粗提物對奇異變形桿菌有不同程度的抑菌作用，其中地榆、虎杖、大黃、黃芩、大青葉和綿馬貫眾6種中藥的抑菌作用最強(qiáng)，另外17種中藥水溶性粗提物均無抑菌活性。

2.3 中藥水溶性粗提物當(dāng)量效價的測定以慶大霉素和青霉素為參照，對上述6種中藥采用革蘭陰性菌短小芽孢桿菌和革蘭陽性菌藤黃微球菌分別進(jìn)行活力測定。將中藥水溶性粗提物與水密度進(jìn)行質(zhì)量比較換算后，得到表1所示的濃度范圍，在革蘭陰性菌和革蘭陽性菌上中藥水溶性粗提物的抑菌圈與標(biāo)準(zhǔn)品抑菌圈相當(dāng)，均為20mm±2mm，此時中藥水溶性粗提物的效價當(dāng)量于抗生素效價。

2.4 中藥水溶性粗提物抑菌活性驗(yàn)證使用微量稀釋法和管碟法進(jìn)行驗(yàn)證。當(dāng)慶大霉素濃度為16μg/mL、青霉素濃度為64μg/mL，對選用的表型耐藥奇異變形桿菌無抑菌活性。而6種中藥水溶性粗提物在表1低濃度范圍均具有良好的抑菌活性，結(jié)果見圖1。說明在適當(dāng)條件下，大黃、大青葉、地榆、虎杖、黃芩、綿馬貫眾能夠替代抗生素進(jìn)行革蘭陽性菌和革蘭陰性菌感染的治療。

3 討論

圖1 6種中藥水溶性粗提物對表型耐藥奇異變形桿菌的抑菌效果比較

通過試驗(yàn)結(jié)果可以看出，對于已經(jīng)產(chǎn)生耐藥的細(xì)菌，抗生素單純增加劑量不能達(dá)到抑菌作用，反而成為藥物壓力，促進(jìn)耐藥進(jìn)一步發(fā)展。而中藥與西藥的作用機(jī)理不同，長期使用不易產(chǎn)生耐藥性，且選擇壓力小，是獸醫(yī)臨床替代抗生素的良好選擇。本試驗(yàn)測試了水煎中藥的抑菌效果，但由于中藥中有效成分復(fù)雜，單使用水煎法可能導(dǎo)致有效成分的流失，應(yīng)考察多種提取方法及其提取物的抑菌活性，期待獲得更有效的提取物。且對肉蓯蓉等5種中藥尚待進(jìn)一步研究。

表1 大黃、大青葉、地榆、虎杖、黃芩和綿馬貫眾的當(dāng)量效價

［1］潘玉善，苑麗，劉建華，等.雞大腸桿菌和奇異變形桿菌的分離，鑒定及藥敏分析［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，21（12）：156-159.

［2］王勇，張輝，宋宏彬，等.一起由奇異變形桿菌引起的食物中毒調(diào)查［J］.中華流行病學(xué)雜志，2007，28（1）：91.

［3］劉毅，盧崇南.一起奇異變形桿菌食物中毒病原學(xué)檢驗(yàn)［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2000，10（2）：198-199.

［4］陳淑惠.奇異變形桿菌致敗血癥1例［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，8（6）：763-763.

［5］張斐，張平，程純，等.奇異變形桿菌毒素研究［J］.南通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），1991，2：003.

［6］汪復(fù)，朱德妹，胡付品，等.2012年中國CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測［J］.中國感染與化療雜志，2013，13（5）：321-330.

［7］李欣南，夏欣，李永才，等.奇異變形桿菌研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2012（12）：73-75.

［8］趙曉彤，周鐵忠，李欣南.我國動物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測現(xiàn)狀與耐藥性控制策略分析［J］.現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2013（12）：45-48.

［9］李樹明，張鳳鳴.50味中藥對8種畜禽病原菌抑菌對比研究［J］.中獸醫(yī)學(xué)雜志，2000（4）：5-8.

［10］張海暉，裘愛泳，劉軍海，等.中藥大黃提取物對幾種畜禽致病菌的抑菌作用研究［J］.飼料工業(yè)，2004，25（11）：24-26.

［11］吳國娟，張中文，李煥榮，等.中草藥對奶牛乳房炎6種致病菌的抑菌效果觀察［J］.北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，18（3）：195-198.

［12］楊希國，李欣南，李香珍，等.雞大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性研究［J］.現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2011（7）：32-34.

［13］蘇葳藝，李欣南，韓鐫竹.某養(yǎng)殖場雞源糞腸球菌分離鑒定及耐藥性研究［J］.現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2014（4）：48-50.

［14］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典［M］.（2005年版一部）.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社:附錄103-105.

S853.72

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0529-6005（2015）12-0059-03

2014-08-05

國家十二五948計(jì)劃獸藥監(jiān)管技術(shù)引進(jìn)［2011-G14（4）］

韓鐫竹（1985-），女，碩士，研究方向?yàn)閯游镌醇?xì)菌耐藥性研究，E-mail：261131312@qq.com

寧宜寶，E-mail：ningyibao@ivdc.gov.cn