鵝細(xì)小病毒吉林株的分離鑒定及其全基因序列分析

孟繁興，董 浩，胡振林，徐 浩，邵洪澤，胡桂學(xué)

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130118；3.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，吉林長春130062）

鵝細(xì)小病毒吉林株的分離鑒定及其全基因序列分析

孟繁興1，董 浩2，胡振林2，徐 浩1，邵洪澤3，胡桂學(xué)1

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130118；3.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，吉林長春130062）

從患病鵝的病料中分離鑒定了2株鵝細(xì)小病毒（Goose parvovirus，GPV），命名為CH株和LS株。參考NCBI中多株GPV全基因序列，分段設(shè)計5對引物，對分離株的全基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序、拼接，并使用生物學(xué)軟件對全基因序列進(jìn)行比對和分析。遺傳進(jìn)化分析顯示，CH株與LS株處于同一分支且相鄰，表明具有較近的親緣關(guān)系。由此推測，兩株病毒可能起源于同一原始毒株。

鵝細(xì)小病毒；分離鑒定；全基因；序列分析

鵝細(xì)小病毒（Goose parvovirus，GPV）屬于細(xì)小病毒科（Parvoviridae）細(xì)小病毒屬成員，該病毒主要侵害3周齡內(nèi)的雛鵝和雛番鴨的急性敗血性傳染病，常被稱為小鵝瘟。鵝細(xì)小病毒最早是由方定一在揚(yáng)州分離到［1］，隨之歐洲10多個國家相繼報道［2-4］。小鵝瘟傳播快，死亡率高，在我國常年流行，給水禽養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，隨著吉林省養(yǎng)鵝業(yè)的快速發(fā)展，小鵝瘟在吉林地區(qū)呈現(xiàn)局部流行的趨勢。2012-2013年間，吉林省長春、梨樹等地區(qū)均出現(xiàn)了疑似小鵝瘟的疫情，本研究從病鵝病料中分離鑒定了2株GPV，并對其的基因組全基因序列進(jìn)行測定，對了解吉林省流行株GPV的基因特征、疾病防治及疫苗選用提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料及鵝胚來源病料來自吉林省長春、梨樹地區(qū)2批發(fā)病雛鵝，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院提供。12～15日齡鵝胚來源于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院吉林白鵝繁育場。

1.2 主要試劑DH5α大腸桿菌感受態(tài)，dNTP，Ex Taq酶，Ex Taq Buffer，pMD-18T試劑盒，EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶等，均購自TaKaRa公司；質(zhì)粒小提試劑盒，購自O(shè)MEGA公司；DNA Gel Ex?traction Kit試劑盒，購自AXYGEX公司。

1.3 引物設(shè)計與合成鑒定引物：GPV F：5′-CCAAGCTACAACAACCACATCTAC-3′；GPV R：5′-CTGCGGCAGGGCATAGACATCCGAC-3′，該引物由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室提供，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，分裝。參考NCBI上公布的GPV全基因序列設(shè)計了5對PCR引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列如下。P1：5′-CTCATTGGAGGGTTCGTTC?GTTCGAA-3′，P2：5′-GCATGCGCGTGGTCAACCTA ACAGCCGGAA-3′，P3：5′-GCATGCCGCGCGGTCAGCCCAATA-3′，P4：5′-TTCAGAATTTGATAGACCC TGTTCTTAGTTA-3′，P5：5′-CACCACTTACTTCCAA CAGAGCG-3′，P6：5′-CAGACTGAGACTGCTGGTTT GG-3′，P7：5′-TGTATTTGAATGTATGGAATGTGAGA-3′，P8：5′-TCAGCCTGTCTAAGTCGTGTG-3′，P9：5′-CATTGCAAACAATCTCACGTCAACGAT-3′，P10：5′-GGATCCACGGCACCCGTC-3′。

1.4 病毒的分離無菌采取病死雛鵝肝臟和小腸內(nèi)容物放入十字勻漿器制備勻漿，除菌，常規(guī)方法接種鵝胚，無菌收集24～120 h死亡鵝胚尿囊液并盲傳3代。

1.5 PCR檢測以第3代鵝胚尿囊液作為模板，用鑒定引物進(jìn)行PCR檢測。反應(yīng)體系如下：模板3μL，10×Ex Taq Buffer 5.0μL，dNTP（10 mmol/L）4.0μL，上/下游引物各0.5μL（10mmol/L），Ex Taq 0.5μL，ddH2O補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)條件均為：95℃10 min、95℃35 s、54℃45 s，72℃30 s，共40個循環(huán)，72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測，結(jié)果為陽性產(chǎn)物送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.6 全基因分段PCR提取病毒DNA溶液為模板用于擴(kuò)增GPV全基因的5個片段。PCR反應(yīng)體系：DNA模板1μg，10×Ex Taq Buffer 5.0μL，dNTP（10mmol/L）4.0μL，P1/P2（P3/P4、P5/P6、P7/P8、P9/ P2）各0.5μL（10mmol/L），Ex Taq 0.5μL，dd H2O補(bǔ)足50μL。反應(yīng)條件為：95℃10 min，95℃35 s，55℃45 s（片段2和3為58℃，片段4和5為60℃），72℃30 s，共30個循環(huán)，72℃延伸10min。1.7全基因各片段純化及克隆5種PCR產(chǎn)物分別經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，并用AXYGEX的DNA回收試劑盒純化。參照TaKaRa公司pMD-18T載體試劑盒說明書，取上述5種PCR膠回收純化產(chǎn)物與pMD-18T載體進(jìn)行連接，鑒定呈陽性的菌落接種LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至混濁，提取質(zhì)粒并進(jìn)行質(zhì)粒PCR鑒定。

1.8 序列測定及分析將PCR鑒定呈陽性的質(zhì)粒送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。使用DNAStar生物學(xué)軟件對所測得的序列和GenBank上發(fā)表的毒株（見表1）進(jìn)行分析。

表1 主要參考毒株信息

2 結(jié)果

2.1 PCR鑒定分別取兩份病料的第3代鵝胚尿囊液作為模板，PCR檢測GPV。結(jié)果如圖1所示，均在375 bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 GPV PCR鑒定結(jié)果

2.2 基因組分段PCR以第3代含GPV CH株和LS株尿囊液所提取的DNA溶液作模板用于擴(kuò)增GPV全基因的5個片段，結(jié)果如圖2所示，1～5大小分別約為180 bp、1 070 bp、1 350 bp、1 460 bp、1 660 bp的PCR產(chǎn)物，均符合預(yù)期結(jié)果。

圖2 GPV全基因PCR結(jié)果

2.3 全基因序列分析GPVCH株和LS株經(jīng)拼接后均為5 050 nt，末端回文序列（ITR）均為416 nt。VP蛋白均由1 844 nt編碼，NS蛋白均由2 199 nt編碼。CH株和LS株的ITR與NS蛋白之間都存在92 nt非編碼區(qū)，NS和VP基因間也均存在18 nt的接頭。CH株和LS株的末端回文序列（ITR）均長416 nt，并且高度同源，只相差3個堿基（157T/C、323A/C、349T/ C）。ITR位于NS基因和VP基因兩端，均形成發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)，其中還含有大量的4～10 nt重復(fù)序列。兩端ITR長為416 nt，可折疊形成“U”形雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)中含有167 nt的無錯配“莖”部和44 nt的“泡”區(qū)，外形如“箭”狀，在箭頭中間有一個序列為GCATGC的Sph I內(nèi)切酶位點(diǎn)。

應(yīng)用MegAlign軟件分析GPV全基因的同源性，繪制表格（圖3），從圖表中可以看出，CH株和LS株具有很高同源性，為98.8%。CH株、LS株與SHFX1201株的同源性分別為99.6%和98.8%。制作系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4），發(fā)現(xiàn)CH株與LS株處于同一分支上，且相鄰，表明親緣關(guān)系極其相近。此外，這2株與臺灣地方分離株82-0321的親緣關(guān)系較近。

圖3 14株GPV全基因同源性

圖4 14株GPV全基因進(jìn)化樹

3 討論

隨著養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，養(yǎng)鵝業(yè)也在迅速的擴(kuò)大，但小鵝瘟給養(yǎng)鵝業(yè)帶來很大的經(jīng)濟(jì)損失，近年來不斷有小鵝瘟的報道。本次吉林地區(qū)小鵝瘟疫情的暴發(fā)，可能是由于本地雛鵝供應(yīng)不足，外地鵝只大量涌入，導(dǎo)致一些傳染性疾?。òㄐ※Z瘟）傳入。由于成年鵝的隱性帶毒，檢疫時不容易發(fā)現(xiàn)，這樣外來的GPV就隨著鵝只進(jìn)入吉林省，短短幾年內(nèi)就可傳變整個省。本試驗對吉林地區(qū)疑似小鵝瘟死亡的病鵝進(jìn)行病毒的分離與鑒定。結(jié)果分離鑒定得到2株GPV。針對全基因設(shè)計引物，克隆、測定全基因序列。經(jīng)全基因序列比對分析發(fā)現(xiàn)，CH株與LS株的核苷酸同源性為98.8%，與上海SHFX1201株的核苷酸同源性分別為99.6%和98.8%遺傳進(jìn)行分析可知，這3株在進(jìn)化樹上分布相距較近，親緣關(guān)系相對較近。由此推測，CH株、LS株與SHFX1201株可能源自同一原始毒株。上海SHFX1201株分離自2012年1月，而CH株、LS株均分離在這之后。上海和吉林地區(qū)同一時期內(nèi)出現(xiàn)親緣關(guān)系如此相近的毒株引起的小鵝瘟，說明它們的原始毒株分布廣泛，可能在上海至吉林之間的這些省份均有存在；吉林地區(qū)的小鵝瘟病原可能是由上海傳入的。

根據(jù)現(xiàn)有的14株GPVNS-VP基因初步判斷，中國目前所分離的GPV毒株主要有2個基因特點(diǎn)，一是以5 050 nt為基本骨架，其代表毒株為YZ99-6株，其類似毒株有82-0321株、06-029株、SHFX1201株、CH株和LS株，其基因組全長約為5 050 nt，末端反向重復(fù)序列（ITR）在414～418之間。此基因類型中還包括不典型的ITR為444 nt或443 nt的安徽Y株和E株，全長為5 125 nt和5 104 nt。二是以5 106 nt為基本骨架，其代表毒株為SH株、SYG61V株。疫苗株GDaGPV株也屬于此基因型，說明其種源毒也屬于該類群。其全基因長5102～5106 nt，ITR為442～444 nt。國內(nèi)鵝細(xì)小病毒的系統(tǒng)研究，尤其是分子流行病學(xué)調(diào)查方面的工作開展較少，大陸研究者更是很少對GPV全基因測序，導(dǎo)致病毒溯源的困難和GPV病毒基因分型的盲目，這給弱毒疫苗的研制帶來一定的影響。所以對GPV全基因測序分析是有必要的，這對病毒的基因分型和疫苗的研制都有意義。

［1］方定一.“小鵝瘟”的介紹［J］.中國畜牧獸醫(yī)，1962（08）：19-20.

［2］Hlinak A，Muller T，Kramer M，et al.Serological survey of viral pathogens in bean and white～fronted geese from Germany［J］.Jour? nal ofWildlife Diseases，1998，34：479-486.

［3］Cough D，Ceeraz V，Cox B，et al.Isolation and identification of goose parvovims in the UK［J］.Veterinary Record，2005，26（3）：424-424.

［4］Irvine R，Ceeraz V，Cox B，et al.Goose parvovirus in Great Brit?ain［J］.Veterinary Record，2008，163（15）：461.

Isolation and Identification and W hole-genome Sequence Analysis of Goose Parvovirus Jilin Strains

MENG Fan-xing1，DONGHao2，HU Zhen-lin2，XU Hao1，SHAO Hong-ze3，HU Gui-xue1
（1.College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2.College of Life Science，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；3.Jilin Academy of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Changchun 130062，China）

In this study，we successfully isolated and identified two strains of Goose parvovirus（GPV）from samples of sick goose and named the two strains as CH strain and LS strain.Referred to whole-genome sequence ofmultiple strains of GPV in NC?BI，we designed five pairs of primers，and amplified the samples by PCR.Then，we sequenced thewhole-genome sequence of the isolated strains and used biology software to compare and analyze the whole-genome sequence.Phylogenetic analysis showed that CH strain and LS strain were in the same branch and next to each other，indicating that they have relatively closer genetic relation?ship.Thus，we infer that the two virusesmay be originated from the same original strain.

Goose parvovirus；Isolation and identification；Whole genome；Sequence analysis

HU Gui-xue

S852.65+9.2

A

0529-6005（2015）12-0033-03

2015-03-23

吉林省科技發(fā)展計劃項目（20130522086JH）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項科研基金（20112223110002）；吉林省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金（201231）；吉林省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（2015209）

孟繁興（1984-），男，博士生，研究方向為鵝細(xì)小病毒研究，E-mail：281018379@qq.com

胡桂學(xué)，E-mail：huguixue901103@163.com