固相萃取—高效液相色譜法測定漁業(yè)水體中16種多環(huán)芳烴

萬譯文　黃向榮　李小玲　等

摘要：漁業(yè)水體樣品經(jīng)HLB小柱凈化和富集，采用熒光-紫外檢測器串聯(lián)方法對多環(huán)芳烴進行檢測，結(jié)果表明，高效液相色譜分析方法對16種多環(huán)芳烴分離效果好，檢出限（LOD）為0.001～0.01 μg/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～9.5%（n=6），加標(biāo)回收率為72.1%～98.3%。該方法重現(xiàn)性和選擇性較高，對水體多環(huán)芳烴的殘留測定具有很好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：固相萃取；高效液相色譜法；多環(huán)芳烴；漁業(yè)水體

中圖分類號： X131.2文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0280-04

收稿日期：2014-01-08

基金項目：湖南省養(yǎng)殖業(yè)科研項目（編號：201115）。

作者簡介：萬譯文（1984—），男，湖南張家界人，碩士，助理研究員，從事食品質(zhì)量與環(huán)境分析化學(xué)研究。E-mail：cnjs3385@163.com。

通信作者：黃向榮，副研究員，從事水產(chǎn)品質(zhì)量安全和漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測研究。E-mail：hns-11@126.com。多環(huán)芳烴（PAHs）類化合物是一種性質(zhì)穩(wěn)定、惰性較強的碳氫化合物，具有疏水性、半揮發(fā)性及難降解等特點，容易在生物體內(nèi)富集[1-3]。PAHs能抑制植物的生長，對人類有明顯的致癌、致畸、致突變效應(yīng)，已成為世界范圍的研究熱點[4-5]。歐盟食品科學(xué)委員會與美國環(huán)保局（USEPA）在2002年將16種PAHs列為優(yōu)先控制污染物，我國環(huán)?？偩謱⑵渲?種PAHs列入優(yōu)先控制污染物名單。

我國是漁業(yè)大國，也是世界上最大的漁業(yè)養(yǎng)殖國，隨著我國工業(yè)化及城市化的快速發(fā)展，燃煤、燃油被廣泛應(yīng)用，產(chǎn)生的污染物不斷排入水域中，對漁業(yè)養(yǎng)殖帶來很大危害，并影響我國水產(chǎn)品出口和人民身體健康。目前，多環(huán)芳烴的檢測方法主要有氣相色譜法（GC）、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS）、高效液相色譜法（HPLC）、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS）等[6-11]。徐媛等采用氫火焰離子化檢測器（FID）氣相色譜法對海水中多環(huán)芳烴進行檢測[12]；牛宏亮等利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（FID-GC-MS）測定烤羊肉串中的多環(huán)芳烴[13]；林直宏等采用高效液相色譜-紫外法測定油漆中的16種多環(huán)芳烴[14]，但不能滿足水體中低濃度樣品的分析要求；孫秀梅等采用高效液相色譜-熒光法測定水產(chǎn)品中的15種多環(huán)芳烴[15]，雖能滿足水體中低濃度樣品的分析，但苊烯在熒光檢測器上沒有響應(yīng)，且采用單一波長不能測定除苊烯外的15種PAHs、梯度洗脫效果不佳。

氣相色譜法對高溫下易分解的高環(huán)PAHs檢測靈敏度不高、回收率不理想；采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對各種PAHs能獲得較為理想的回收率和精密度，但前處理復(fù)雜，耗時長，有機溶劑使用多；高效液相色譜法可選紫外和熒光檢測器用于環(huán)境中PAHs的測定。本試驗采用固相萃取技術(shù)對水樣進行處理，通過對試驗條件篩選和試驗方法改進，利用高效液相色譜-熒光紫外聯(lián)測定漁業(yè)水體中的16種多環(huán)芳烴，以期縮短前處理時間，提高試驗靈敏度，實現(xiàn)對多環(huán)芳烴的快速檢測。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

Waters Alliance 2695高效液相色譜儀，配備2489紫外可見光檢測器和2475多波長熒光檢測器；4.6 mm×250 mm、5 μm Waters LC-PAH柱；高速冷凍離心機，日本日立公司生產(chǎn)；氮氣吹掃儀，美國Organomation公司生產(chǎn)；固相萃取裝置，美國Agilent公司生產(chǎn)；整套過濾抽濾裝置，天津奧特賽恩斯儀器有限公司生產(chǎn)；循環(huán)水式多用真空泵SHZ-D（Ⅲ），鄭州長城科工貿(mào)有限公司生產(chǎn)。

萘、苊、菲、蒽、芴、芘、、熒蒽、苊烯、苯并[a]蒽、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、苯并[a]芘、二苯并[a，h]蒽、苯并[g，h，i]苝和茚并[1，2，3-cd]芘共16種多環(huán)芳烴混合標(biāo)液，濃度200 mg/L，美國Accustandard公司生產(chǎn)；甲醇色譜純、乙腈色譜純，德國Merck公司生產(chǎn)；二氯甲烷色譜純，美國Tedia公司生產(chǎn)；HLB 6 mL/500 mg固相萃取小柱，美國Waters公司生產(chǎn)。

1.2樣品前處理

1.2.1樣品采集與改性劑用量篩選取樣點水深1.5～3 m，將采集的水樣用干凈的棕色玻璃容器盛裝，加入不同濃度甲醇作為有機改性劑并進行篩選。水樣置于暗處，4 ℃冰箱保存，并在24 h內(nèi)盡快進行樣品預(yù)處理。

1.2.2樣品處理條件篩選將1 L水樣加標(biāo)樣通過 0.45 μm 水相濾膜過濾；分別取C18、HLB、MCX、Alumina-N4種固相萃取柱500 mg/6 mL依次通過5 mL甲醇、10 mL水活化小柱，將過濾好的水樣分別以5、8、10、20 mL/min左右流速通過萃取柱；依次用5 mL水、2 mL 5%甲醇淋洗以除去水溶性干擾物質(zhì)，抽干小柱，使吸附好的SPE柱徹底干燥；分別采用4 mL二氯甲烷1次、4 mL二氯甲烷2次和9 mL二氯甲烷3次共3種方式進行洗脫，洗脫液用不同溫度氮氣將溶劑吹干或濃縮至約0.5、0.1 mL 3種情況，加入1.0 mL乙腈混勻，過0.22 μm濾膜。1 L待測水樣用最佳條件進行處理。

1.3色譜條件優(yōu)化

歐盟規(guī)定16種多環(huán)芳烴采用Waters 2695熒光檢測器檢測，由于苊烯熒光響應(yīng)值低，但在紫外檢測器中響應(yīng)值較高，因此，采用熒光和紫外串聯(lián)的方法對16種多環(huán)芳烴進行檢測，通過試驗分析對色譜條件予以優(yōu)化。

1.4多環(huán)芳烴測定

采用2475多波長熒光檢測器，程序定時控制熒光檢測波長變化，測定除苊烯以外的15種多環(huán)芳烴（表1）；采用2489紫外可見光檢測器，與熒光檢測器串聯(lián)，于波長229 nm處檢測定苊烯。

2結(jié)果與分析endprint

2.1改性劑用量篩選

PAHs在水中溶解度較低，在水樣采集過程中加入甲醇作為改性劑，可以改變目標(biāo)物在水中的溶解性，增加PAHs在固相萃取柱填料表面的吸附能力，可以提高對目標(biāo)物的提取效率。比較水樣中分別加入0%、5%、10%、15% 4種甲醇用量對PAHs回收率的影響，由圖1可見，水樣不加入甲醇，16種PAHs回收率為47.6%～68.3%；分別加入5%、10%、15%

甲醇，16種PAHs回收率分別為51.8%～73.5%、68.6%～902%、59.7%～79.3%；添加10%甲醇作為改性劑可使16種PAHs溶解度得到較大改善，PAHs回收率提高，但當(dāng)甲醇加入量過大時，部分PAHs會隨水樣直接通過小柱而不被小柱吸附，導(dǎo)致回收率降低。

2.2水樣固相萃取處理條件篩選

2.2.1固相萃取小柱篩選由圖2可見，采用HLB固相萃取小柱對16種PAHs的回收相對最好，回收率為60.8%～88.6%；普通C18柱對PAHs中菲和蒽、苯并[b]熒蒽和苯并[k]熒蒽的分離效果不好。HLB固相萃取柱是一種高效、通用的反相吸附劑，可提取各種不同樣品基質(zhì)中酸性、中性及堿性物質(zhì)，操作性能穩(wěn)定且具有大的樣品容量，可獲得較高的回收率。

2.2.2洗脫方式篩選對目標(biāo)物洗脫方式進行試驗，結(jié)果表明，4 mL二氯甲烷進行1次洗脫，目標(biāo)物洗脫不完全，還有部分目標(biāo)物殘留在組合SPE柱上；4 mL二氯甲烷分2次（2×20 mL）洗脫，目標(biāo)物被完全洗脫，回收率良好；9 mL二氯甲烷分3次（3×3.0 mL）洗脫，回收率與2次洗脫淋洗幾乎相同。因此，試驗選擇操作簡單、節(jié)約試劑的2次洗脫方式。

2.2.3水樣上樣流速篩選比較上樣流速分別為5、8、10、20 mL/min對目標(biāo)物回收率的影響，結(jié)果表明，當(dāng)流速小于 10 mL/min 時，回收率比較穩(wěn)定；流速大于10 mL/min，部分PAHs的回收率降低，這可能是由于流速過快，部分目標(biāo)物來不及吸附在小柱填料上。因此，試驗采用上樣流速為8 mL/min。

2.2.4氮吹條件的考察將PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同溫度水浴中進行氮吹，結(jié)果表明，水浴溫度高低對PAHs無明顯影響；水浴溫度適當(dāng)提高，能夠加快氮吹速度，縮短前處理時間，因此，為減少氮吹過程帶來的影響，試驗采用60 ℃水浴氮吹。比較氮吹過程中溶劑濃縮程度對PAHs回收率的影響，結(jié)果表明，溶劑吹干會大大降低萘、苊、芴、菲等PAHs的回收率，將溶劑濃縮至約0.1 mL時PAHs回收率較好。

2.3色譜條件優(yōu)化

采用Waters的PAH專用柱，對流動相、柱溫及流速等因素進行優(yōu)化。由圖3、圖4可見，色譜條件為Waters LC-PAH色譜柱，柱溫30 ℃，進樣量20 μL，流動相A為乙腈，B為超純水，流速為1.2 mL/min，洗脫梯度為0～11 min 60%A、11～20 min 60 %A～90%A、21～32 min 90%A，16種多環(huán)芳烴均能得到較好的分離。

2.4線性方程與檢出限

配制0.001、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以待測物濃度X（mg/L）為橫坐標(biāo)，待測物峰面積Y為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到PAHs回歸方程和相關(guān)系數(shù)。由表2可知，PAHs在0.001～0.1 mg/L范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，可滿足定量分析要求。以苯并（a）芘計，在500 mL純水中添加0.1 mg/L PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液2 μg，對樣品進行處理和濃縮，3倍信噪比（S/N=3）得到檢出限LOD為0.001～001 μg/L。

2.5回收率與精密度

以苯并（a）芘計，在空白樣品中添加1.0 mg/L PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10.0、100 μL，每個添加水平重復(fù)3次，每次平行測定6次，由表3可見，PAHs回收率為72.1%～98.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～9.5%。

2.6實際樣品測定

由表4可見，經(jīng)檢測，長沙市水產(chǎn)品養(yǎng)殖基地水樣中含有萘、苊、芴、菲、熒蒽、芘、共7種多環(huán)芳烴物質(zhì)，其中，以芘含量最高，為38.9 ng/L。

3結(jié)論

通過對固相萃取過程及色譜條件進行優(yōu)化，建立固相萃取-高效液相色譜法檢測漁業(yè)水體中PAHs的含量。結(jié)果表明，在0.001～0.1 mg/L范圍內(nèi)，該方法檢測PAHs線性關(guān)系良好，檢出限LOD在0.001～0.01 μg/L之間；在不同添加水平下，PAHs各組分平均回收率為72.1%～98.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～9.5%， 可滿足漁業(yè)水體中微量和痕量 PAHs表216種PAHs的線性范圍和靈敏度

目標(biāo)物線性范圍

（mg/L）線性方程r2LOD

（μg/L）萘 （NAP）0.001～0.1Y=3.301 42+0.231 26X0.999 60.010苊烯 （ACY）0.001～0.1Y=-1.425 11+1.030 91X0.999 80.010苊 （ACE）0.001～0.1Y=39.763 10+2.337 53X0.999 80.003芴 （FLU）0.001～0.1Y=-3.528 34+3.174 33X0.999 80.003菲 （PHE）0.001～0.1Y=0.216 84+0.326 149X0.999 60.001蒽 （ANT）0.001～0.1Y=44.000 7+10.348 53X0.999 80.003熒蒽 （FLT）0.001～0.1Y=11.256 4+1.753 75X0.999 60.002芘 （PYR）0.001～0.1Y=3.529 52+0.552 13X0.999 90.001苯并[a]蒽 BaA0.001～0.1Y=0.027 65+2.838 61X0.999 90.002 （CHR）0.001～0.1Y=0.271 23+1.460 83X0.999 90.002苯并[b]熒蒽 （BbF）0.001～0.1Y=0.199 36+0.735 16X0.999 90.002苯并[k]熒蒽（BkF）0.001～0.1Y=-0.107 48+5.568 51X0.999 70.001苯并[a]芘 （BaP）0.001～0.1Y=-0.173 02+4.369 15X0.999 90.001二苯并[a，h]蒽 （DBA）0.001～0.1Y=-0.162 36+2.346 33X0.999 90.002苯并[g，h，i]苝 （BPY）0.001～0.1Y=-0.138 87+1.018 97X0.999 80.002茚并[1，2，3-cd]芘 （IND）0.001～0.1Y=-0.052 488+0.225 11X0.999 70.010endprint