基于EDS的魚(yú)類耳石微化學(xué)分析實(shí)驗(yàn)條件選擇

郭弘藝， 張旭光， 邵 露， 殷曦敏

(上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306)

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基于EDS的魚(yú)類耳石微化學(xué)分析實(shí)驗(yàn)條件選擇

郭弘藝， 張旭光， 邵 露， 殷曦敏

(上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306)

研究能譜儀在魚(yú)類耳石微化學(xué)分析中的應(yīng)用，探索一套適用于魚(yú)類耳石標(biāo)準(zhǔn)樣品定量分析實(shí)驗(yàn)條件。結(jié)果表明，樣品表面粗糙會(huì)對(duì)特征X射線產(chǎn)生幾何效應(yīng)，使得分析強(qiáng)度降低，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差。耳石樣本最適用烘干干燥法，其操作過(guò)程為：耳石放入干凈培養(yǎng)皿后，在恒溫烤箱60 °C烘干6～8 h。樣品干燥后，表面噴金待用。為獲得精確的分析結(jié)果，實(shí)驗(yàn)參數(shù)應(yīng)根據(jù)樣品大小，實(shí)驗(yàn)?zāi)康乃枰P(guān)注的組成元素和儀器性能來(lái)選擇。加速電壓Uo一般為臨界激發(fā)電壓Uk的2～10倍。最適工作距離為20 mm，單點(diǎn)掃描活時(shí)間為200 s以上，死時(shí)間10%～15%。聚焦參數(shù)應(yīng)該根據(jù)耳石樣品不同的大小選擇，盡可能兼顧縮短測(cè)量時(shí)間和保證足夠的空間分辨率。

耳石； 掃描電鏡； 能譜儀； 魚(yú)類

0 引 言

魚(yú)類耳石具有代謝惰性，在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，水環(huán)境中的化學(xué)元素一旦被耳石沉積，就很難再被機(jī)體吸收，成為記錄魚(yú)類生活史的元素指紋。因此，耳石微化學(xué)分析已成為解決魚(yú)類生活史及環(huán)境史重新構(gòu)建、出生地溯源、混合群體識(shí)別、種群鑒定、海洋環(huán)境反演等問(wèn)題的關(guān)鍵技術(shù)[1-5]。

X射線能量色散譜分析(Energy Dispersive X-Ray Spectroscopy, EDS)，簡(jiǎn)稱X-射線能譜分析，是20世紀(jì)70年代迅速發(fā)展起來(lái)的一種元素測(cè)試技術(shù)，可配置在掃描電子顯微鏡或透射電子顯微鏡上，能對(duì)樣品做無(wú)損傷分析，具有操定性、定位和定量分析一次完成的優(yōu)點(diǎn)[6-14]。目前，國(guó)內(nèi)眾多科研院校均配置了掃描電子顯微鏡與能譜儀，但對(duì)魚(yú)類微化學(xué)領(lǐng)域研究較少，特別缺乏魚(yú)類耳石微化學(xué)研究的能譜分析實(shí)驗(yàn)手段和技術(shù)研究。本文利用我校現(xiàn)有的日立S-3400N型掃描電鏡配置布魯克 QUANTAX 400-10 型能譜儀，基于EDS的魚(yú)類耳石微化學(xué)分析實(shí)驗(yàn)條件的進(jìn)行探索和研究，以期為從事該領(lǐng)域研究的人員提供幫助。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 主要儀器

SEM 試驗(yàn)儀器為日立S-3400N型掃描電鏡；EDS試驗(yàn)儀器為布魯克 QUANTAX 400-10 型能譜儀(ESPRIT 1. 9 軟件系統(tǒng))；探測(cè)器為SSD硅漂移探測(cè)器。

1.2 試驗(yàn)樣品

分析樣品為刀鱭成魚(yú)和日本鰻鱺幼魚(yú)的矢耳石(見(jiàn)圖1)。

圖1 刀鱭成魚(yú)和日本鰻鱺幼魚(yú)耳石

1.3 分析流程

分析流程如圖2所示，重復(fù)多次測(cè)試，篩選最適合實(shí)驗(yàn)條件。

2 結(jié)果和分析

2.1 耳石樣品制備和實(shí)驗(yàn)前預(yù)處理

2.1.1 耳石制備

已有研究表明，樣品表面粗糙會(huì)對(duì)特征X射線產(chǎn)生“幾何效應(yīng)”：一方面是所產(chǎn)生的一部分X射線射出后被邊緣突起部分吸收；另一方面在不同角度的表面上所產(chǎn)生的X射線，有相當(dāng)一部分背離探測(cè)器的方向。由于這兩部分X射線的損失，使得分析強(qiáng)度降低，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，表面未經(jīng)拋光的耳石樣品分析誤差明顯大于均勻打磨至100 μm薄片的耳石誤差，均一厚薄光滑表面的耳石樣品較未經(jīng)處理的不均一粗糙表面樣品，鈣和鍶元素分析誤差分別由4%和8.9%降至1%和5.8%(見(jiàn)表1)。由此可見(jiàn)，耳石樣品需打磨成為厚薄均一的耳石薄片。

圖2 EDS分析流程示意圖 表1 EDS法分析耳石表面元素含量及其相對(duì)誤差

元素未打磨拋光的樣品打磨至100μm均勻薄片樣品鈣Ca鍶Sr含量×10-6251236.7±9931.4236813.2±2402.3誤差/%4.01.0含量×10-63225.6±285.82703.8±155.8誤差/%8.95.8

2.1.2 干燥法的選擇

掃描電鏡生物樣品制備常用干燥方法包括自然干燥法、烘干干燥法、冷凍干燥法、臨界點(diǎn)干燥法和真空干燥法。5種方法均可用于耳石的干燥，比較而言，冷凍干燥法、臨界點(diǎn)干燥法和真空干燥法或需要專門(mén)設(shè)備和試劑，或操作復(fù)雜，而自然干燥法受溫度和濕度影響且耗時(shí)長(zhǎng)。因此，耳石樣本最適用烘干干燥法，此法干燥速度較快，操作簡(jiǎn)單，所需設(shè)備容易獲得。其操作過(guò)程為：耳石放入干凈培養(yǎng)皿后，在恒溫烤箱60 °C烘干6～8 h。需要注意的是，恒溫烤箱溫度設(shè)置過(guò)高，易導(dǎo)致耳石碎裂，而烘烤溫度設(shè)置太低，干燥所需時(shí)間長(zhǎng)。

2.1.3 表面噴鍍材料選擇

耳石樣品不導(dǎo)電，測(cè)試前需經(jīng)過(guò)噴金(Au)或噴碳(C)處理。由于耳石的主要元素為Ca、C、O，以碳酸鈣(CaCO3)的形式存在，噴碳可能造成C含量疊加，因此，選擇噴Au更為合適。同時(shí)，在分析時(shí)，控制窗口Element list中選中Au元素，將其設(shè)定為Deconvolution元素，即普線圖上仍顯示Au元素譜峰，但不納入后續(xù)定量計(jì)算。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

2.2.1 加速電壓的選擇

使用EDS分析耳石元素含量時(shí)，首先，應(yīng)選擇合適的加速電壓Uo，并檢查過(guò)壓比。過(guò)壓比為“加速電壓Uo與某一分析元素給定譜線的臨界激發(fā)電壓Uk的比值”。當(dāng)過(guò)壓比低于50%，被激發(fā)元素的相互作用體積很小，不足以應(yīng)用于X射線分析；當(dāng)過(guò)壓比大于10倍時(shí)，低能量的X射線會(huì)逃逸，造成很大誤差。例如，當(dāng)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中關(guān)注Ca和Sr元素的含量，激發(fā)Ca和Sr的Kα能量分別為3.7和14.1 keV，同時(shí)，兼顧兩者的分析效果，實(shí)驗(yàn)選取30 kV加速電壓。

2.2.2 探測(cè)器工作距離

當(dāng)探測(cè)器調(diào)到最佳工作位置時(shí)，才可獲取最佳分析效果，得到最高探測(cè)能效。本研究中，日立S-3400N型掃描電鏡附帶布魯克 Quantax 400-10 型能譜儀的工作距離是20 mm。

2.2.3 采集時(shí)間

耳石定量分析所需單點(diǎn)掃描活時(shí)間為200 s以上，死時(shí)間*死時(shí)間,是指射入檢測(cè)器的沒(méi)被采用的X射線信號(hào)10%～15%，效果較好。面掃描和線掃描在不精確定量，僅分析耳石內(nèi)元素空間變化的情況下，可根據(jù)樣品情況和分析要求，降低單點(diǎn)掃描活時(shí)間。

2.2.4 聚焦參數(shù)選擇

束斑大小選擇要同時(shí)兼顧盡可能短的測(cè)量時(shí)間和足夠的空間分辨率。當(dāng)樣品為成魚(yú)耳石時(shí)，如刀鱭成魚(yú)耳石，耳石半徑約2 000 μm，生長(zhǎng)率為50 μm/周。因此，束斑可選擇25 μm左右，即得到足夠的空間分辨率反映生活史中元素變化；當(dāng)樣本為仔幼魚(yú)耳石時(shí)，如日本鰻鱺幼魚(yú)耳石，耳石半徑為150 μm，生長(zhǎng)率為0.5～2 μm/日。此時(shí)，束斑應(yīng)選擇2～5 μm，以探得生活史中元素變化。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的選擇

按照《電子探針和掃描電鏡X射線能譜定量分析通則》，應(yīng)選擇與分析樣品基質(zhì)性質(zhì)接近，厚度相同的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，同時(shí)，分析樣品和標(biāo)樣應(yīng)在相同分析條件下采集譜圖，從而保證分析的精確度。據(jù)此，我們選用加拿大國(guó)家研究委員會(huì)提供的新型魚(yú)類耳石標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(FEBS-1)。該標(biāo)樣由4.5 kg干燥的西大西洋笛鯛矢耳石制備而成，適用于定量鋇、鈣、鋰、鎂、錳、鈉和鍶7種元素。其基質(zhì)成分與分析樣品比較接近，同時(shí)，F(xiàn)EBS-1為粉末狀，可靈活制備成不同厚度，以適用于不同大小魚(yú)類耳石的定量分析。

3 結(jié) 語(yǔ)

在EDS分析前，應(yīng)將魚(yú)類耳石打磨成為厚薄均一的耳石薄片，恒溫烤箱60 °C干燥6～8 h后，表面噴金待用。EDS分析實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)根據(jù)樣品大小，實(shí)驗(yàn)參數(shù)應(yīng)根據(jù)樣品大小，實(shí)驗(yàn)?zāi)康乃枰P(guān)注的組成元素和儀器性能來(lái)選擇。Uo一般為臨界激發(fā)電壓Uk的2～10倍。本研究中的日立S-3400N型掃描電鏡附帶布魯克Quantax 400-10型能譜儀的最適工作距離為20 mm，單點(diǎn)掃描活時(shí)間為200 s以上，死時(shí)間10%～15%。聚焦參數(shù)應(yīng)該根據(jù)耳石樣品不同的大小選擇，盡可能兼顧縮短測(cè)量時(shí)間和保證足夠的空間分辨率。研究結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)FEBS-1是基質(zhì)成分與耳石接近，厚薄大小可靈活制備，滿足魚(yú)類耳石微化學(xué)定量分析。

[1] Esser B K, Volpe A M. At-sea high-resolution chemical mapping: extreme barium depletion in North Pacific surface water[J]. Marine chemistry, 2002, 79(2): 67-79.

[2] Olsson P E, Kling P, Hogstrand C. Metal metabolism in aquatic environments[M]. London: Chapman and Hall, 1998: 321-350.

[3] Yabutani T, Mouri F, Itoh A,etal. Multielement monitoring for dissolved and acid-soluble concentrations of trace metals in surface seawater along the ferry track between Osaka and Okinawa as investigated by ICP-MS[J]. Analytical sciences, 2001, 17(3): 399-406.

[4] 張 亞, 郭弘藝, 唐文喬, 等. 長(zhǎng)江口日本鰻鱺幼體矢耳石元素的SRXRF分析[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 22(6):821-826.

[5] Guo H Y, Zheng Y, Tang W Q,etal. Behavioral migration diversity of the Yangtze River Japanese Eel, Anguilla japonica, based on otolith Sr/Ca ratios[J]. Zoological Research, 2011, 32(4):442-450.

[6] 孟 克. 植物樣品的EDX微區(qū)定量分析研究[D]. 北京：北京林業(yè)大學(xué), 2009.

[7] 楊勇驥. 實(shí)用生物醫(yī)學(xué)電子顯微鏡技術(shù)[M]. 上海：第二軍醫(yī)大學(xué)出版社, 2003:188-197.

[8] 龔 力, 陳 建, 謝方艷, 等. 光電子能譜儀新增功能研發(fā)[J]. 實(shí)驗(yàn)室研究與探索, 2011(11): 231-233.

[9] 楊健茂, 劉曉云, 路 平, 等. 不均勻易損傷靜電紡絲樣品掃描電鏡表征[J]. 實(shí)驗(yàn)室研究與探索, 2013(10): 253-255.

[10] 王奕文, 劉 歡, 倪 兵. 生物電鏡觀測(cè)網(wǎng)上預(yù)約追蹤系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)[J]. 實(shí)驗(yàn)室研究與探索, 2014(1): 133-13.

[11] 時(shí)巧翠, 嚴(yán)愷倫, 林順雷, 等. 掃描電鏡/能譜儀在刑事技術(shù)中的應(yīng)用[J]. 實(shí)驗(yàn)室研究與探索, 2010(10): 32-35.

[12] 吳勤祖. 電鏡維修技術(shù)探討[J]. 實(shí)驗(yàn)室研究與探索, 1992(3): 30-34.

[13] 李 慧, 張靜武. 拍攝高質(zhì)量透射電鏡照片的經(jīng)驗(yàn)[J]. 實(shí)驗(yàn)室研究與探索, 2002(1): 49-60.

[14] 權(quán)茂華, 孫建林, 熊小濤, 等. 電鏡實(shí)驗(yàn)教學(xué)中“三層次”培訓(xùn)體系的建立[J]. 實(shí)驗(yàn)室研究與探索, 2014(5): 171-174.

[15] 張淑芳, 龔克儉, 李 學(xué), 等. 加速電壓和樣品表明粗糙度對(duì)EDS分析精度的影響[J]. 電子顯微學(xué)報(bào), 1993(4):352-355.

Experiment Condition Selection and Research of Fish Otolith Microchemistry Analysis Based on EDS

GUOHong-yi,ZHANGXu-guang,SHAOLu,YINXi-ming

(Key Laboratory of Freshwater Fishery Germplasm Resources, Ministry of Agriculture,Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

This paper studies the application of spectrometer in fish otolith microchemistry analysis, and explores a set of experiment conditions for quantitative analysis of fish otolith standard samples. For electron microprobe analysis the otoliths were ground into uniform thickness chips, then dried at 60°C constant-temperature oven for 6-8 hours, and finally gold coated in a high-vacuum evaporator. In order to ensure the accuracy of experimental results, experiment parameters should be determined in accordance with otolith size, experimental objective for key composition of fish otolith and instrument performance. Accelerating voltage must be higher than X-ray critical excitation voltage of all element properties measured, which is more than 2 times and less than 10 times of critical excitation voltageUkin general cases. The optimal working distance is 20 mm, with live time of over 200 s and deadtime between 10%-15% in single scan. Focusing parameters should be determined on line with otolith sample size, with full considerations to a short measurement time and sufficient spatial resolution.

otolith; scanning electron microscopy; energy spectrometer; fish

2014-07-07

上海高校實(shí)驗(yàn)技術(shù)隊(duì)伍建設(shè)計(jì)劃(B1-5407-13-0000-1)

郭弘藝(1980-)，女，江蘇揚(yáng)州人，工程師，現(xiàn)主要從事魚(yú)類生物學(xué)研究。Tel.:021-61900445；E-mail:hy-guo@shou.edu.cn

Q 336

A

1006-7167(2015)05-0024-03