人CYP2E1基因編碼蛋白主要特性與結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)分析

林非凡，韓雅莉

(廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東廣州510006)

細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450，CYP450)是生物體內(nèi)一組結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)的超家族基因編碼的同工酶，該酶系對(duì)內(nèi)、外源化合物的轉(zhuǎn)化、失活及活化起著至關(guān)重要的作用，包括參與類固醇激素、維生素、脂肪酸衍生物等內(nèi)源性物質(zhì)的合成和降解［1］，外來(lái)化合物如藥物、環(huán)境污染物、致癌物的代謝等［2］.CYP2E1是CYP450酶系的重要成員之一，其編碼的二甲基亞硝胺D-脫甲基酶是極其重要的I相代謝酶，其主要參與亞硝胺及其前體物和低分子量鹵代氰類化合物在體內(nèi)的代謝，也參與苯、乙醇、四氯化碳和煙草中的3’羥基吡啶等多種低分子量化合物的代謝［3-4］，特別是參與多種前致癌物和前毒物，如亞硝胺、苯胺等物質(zhì)的轉(zhuǎn)化為最終致癌活性物質(zhì)，因此，在多種癌癥易感性中起著重要作用.CYP2E1被認(rèn)為是機(jī)體對(duì)環(huán)境、工業(yè)毒物或致癌物敏感程度的重要決定因素［5-6］.

本文采用生物信息學(xué)方法，對(duì)人CYP2E1基因序列特征、編碼的蛋白結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、空間結(jié)構(gòu)、酶的活性中心和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，從分子水平揭示CYP2E1的作用機(jī)制，為其轉(zhuǎn)化環(huán)境化合物及致癌機(jī)理提供理論依據(jù)，也為污染物的防治提供新的思路與途徑.

1 材料與方法

1.1 序列來(lái)源

人CYP2E1基因及蛋白的GenBank的登錄號(hào)分別為NC000010.11和NM000773.3.

1.2 分析方法

利用NCBI(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)找到CYP2E1的開放閱讀框及編碼蛋白.利用DNAStar軟件的Editseq程序，對(duì)該開放閱讀框編碼氨基酸進(jìn)行翻譯，并分析其氨基酸序列;利用Prot-Param(http:∥www.expasy.ch/tools/prot-param.html)在線工具預(yù)測(cè)人CYP2E1各理化性質(zhì);使用DNAStar軟件的Megalingn程序?qū)θ?、猴、犬、牛、豬、小鼠、大鼠的CYP2E1編碼蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析;利用Tampered(www.ch.embnet.org/software/tepred-form.html)在線工具分析人CYP2E1的跨膜結(jié)構(gòu);采用SignalP(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)在線工具分析CYP2E1編碼蛋白的信號(hào)肽.利用DNAStar軟件中Protean程序和Chou-Fasman法(http:∥www.predictprotein.org/)預(yù)測(cè)人CYP2E1二級(jí)結(jié)構(gòu);利用WOLFPsort軟件預(yù)測(cè)人CYP2E1的亞細(xì)胞定位;利用SWISS-MODEL(http:∥swissmodel.expasy.org/)軟件預(yù)測(cè)CYP2E1三級(jí)結(jié)構(gòu)和酶的活性中心;采用ExPASY的ProtScale(http:∥expasy.org/tools/protscale.html)軟件分析人CYP2E1的親(疏)水性.

2 結(jié)果與分析

2.1 人CYP2E1基因基本信息

人CYP2E1基因定位于第10號(hào)染色體(10q24.3)，其上游為2 788 bp，下游為599 bp，由8個(gè)內(nèi)含子、9個(gè)外顯子和典型的TATA盒組成，其大小為11 413 bp，cDNA長(zhǎng)度為1 497 bp［7］.該基因堿基組成:A=21.1%［397］，G=18.6%［350］，T=19.2%［361］，C=41.1%［362］，Ambigous=0.00%［0］，(A+T)=40.3%［758］，(C+G)=59.7%［712］.顯然，4種堿基比例不平衡.CG含量顯著大于AT含量.CYP2E1基因中存在2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，分別位于其5’端和內(nèi)含子6中［8］.

2.2 人CYP2E1的主要理化性質(zhì)和親(疏)水性預(yù)測(cè)

經(jīng)DNAStar分析人CYP2E1編碼的功能蛋白由493個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為172 386.6 Da.氨基酸組成:堿性氨基酸15個(gè)(K，R)，占3.1%;酸性氨基酸14個(gè)(D，E)，占2.9%;疏水性氨基酸41個(gè)(I，L，F(xiàn)，W，V)，占8.3%;極性氨基酸210個(gè)(N，C，Q，S，T，Y)，占42.5%.等電點(diǎn)理論值7.04，表明人CYP2E1蛋白的極性氨基酸與疏水性氨基酸占有較大比例.經(jīng)ProtParam軟件分析，推測(cè)人CYP2E1的分子式為C6778H10986N2074O2429S374;在波長(zhǎng)280 nm時(shí)吸光度(A值)為1.6;其不穩(wěn)定系數(shù)為44.09;其脂肪族氨基酸系數(shù)為43.79;其總平均親水性是0.583.該蛋白氨基酸組成中Gys、Gly、Thr、Leu含量較高，依次為6.2%、5.8%、4.8%和11.8%，而Trp含量?jī)H為1.0%;其親(疏)水性如圖1所示，存在8個(gè)高疏水性區(qū)域，分別分布于8～23、64～81、168～185、209～214、286～300、308～317、381～396、437～459氨基酸位點(diǎn)處;主要的最小分值區(qū)域位于139、140、141、142、143、144、145和146這8個(gè)氨基酸位點(diǎn)，該區(qū)域?yàn)楦哂H水性區(qū)域.因此，推測(cè)該蛋白是高疏水性蛋白.

圖1 人CYP2E1疏水性分析Fig.1 Hydrophobicity analysis of CYP2E1

2.3 人CYP2E1跨膜結(jié)構(gòu)分析

預(yù)測(cè)與分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)τ跍?zhǔn)確了解蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能以及在細(xì)胞中的定位具有重要意義［9］.本文采用Tampered軟件分析了CYP2E1跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖2所示.根據(jù)預(yù)測(cè)模型，編碼蛋白產(chǎn)生了6次高峰，分別在44～62、99～118、205～223、248～264、327～347以及480～499氨基酸位點(diǎn)處，推測(cè)該蛋白存在6個(gè)跨膜區(qū)域，即一條多肽鏈跨膜折疊，形成由6個(gè)α螺旋段反平行裝配的球狀膜蛋白.推測(cè)該蛋白是跨膜蛋白.

圖2 人CYP2E1的跨膜區(qū)域分析Fig.2 Analysis of transmembrane domains of CYP2E1

2.4 人CYP2E1信號(hào)肽分析

采用SignalP3.0 Server軟件對(duì)CYP2E1進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖3所示，C列為剪切位點(diǎn)得分，S列為信號(hào)肽得分，Y列為綜合剪切位點(diǎn)得分，典型信號(hào)肽的C值和Y值趨向于+1，S值在剪切位點(diǎn)之前高而在剪切位點(diǎn)之后變低，當(dāng)C、Y、S值計(jì)算結(jié)論是YES時(shí)表明預(yù)測(cè)結(jié)果較好［10］.分析結(jié)果表明，CYP2E1肽段分值曲線典型，C值為0.831，Y值為0.659，S值為0.653，C，Y，S均為最大值，其切割點(diǎn)位于第28位和第29氨基酸之間，該蛋白的信號(hào)肽位于第1-28位氨基酸.

2.5 人CYP2E1二級(jí)結(jié)構(gòu)與亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

對(duì)于未知功能蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域或功能單位進(jìn)行確認(rèn)，有助于了解該蛋白的生物學(xué)功能［11］.本文采用Protean程序分析CYP2E1二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖4所示.從圖4可以看出該蛋白中有6段 α-螺旋，分布于9-26，34-79，92-96，110-202，251-279，375-389等氨基酸殘基位點(diǎn)處;有6處β-折疊，分布于210-213，233-237，295-326，349-379，386-401，402-405位點(diǎn);還有32處 β-轉(zhuǎn)角，分布于30-33，63-159，193-221，230-261，276-303，318-367，382-396，408-411等位點(diǎn).人CYP2E1有典型的細(xì)胞色素P450二級(jí)結(jié)構(gòu)，在二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)生緊密的卷曲與折疊，形成三維空間結(jié)構(gòu)，這樣有利于被催化底物可以沿著β1折疊進(jìn)入催化中心部位.采用WOLFPsort軟件對(duì)預(yù)測(cè)該蛋白亞細(xì)胞定位，判斷該蛋白質(zhì)主要定位于膜結(jié)構(gòu)上，最可能分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、過(guò)氧化物酶體、溶酶體與高爾基體等膜上.

圖3 人CYP2E1信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of signal peptide of CYP2E1

圖4 人CYP2E1二級(jí)結(jié)構(gòu)圖Fig.4 Secondary structure of CYP2E1

2.6 人CYP2E1三級(jí)結(jié)構(gòu)和活性中心預(yù)測(cè)

經(jīng)SWISS-MODEL軟件模擬人CYP2E1的高級(jí)結(jié)構(gòu)和活性中心如圖5和圖6所示.預(yù)測(cè)出CYP2E1活性中心的體積約為0.19 nm3，外表為小球狀，整個(gè)分子有6個(gè)α-螺旋和1個(gè)β折疊，Asn202殘基、Ser298殘基以及Phe205殘基有可能與鐵卟啉環(huán)形成活性中心，CYP2E1蛋白血紅素鐵和底物催化位點(diǎn)之間的距離在0.3～0.6 nm之間，在空間上和底物結(jié)合為三明治式的結(jié)構(gòu)，參與催化反應(yīng).

圖5 人CYP2E1三級(jí)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)Fig.5 Tertiary structure of CYP2E1

圖6 人CYP2E1的預(yù)測(cè)活性中心Fig.6 Prediction of the active center of CYP2E1

2.7 人CYP2E1的分子進(jìn)化分析

采用Megalingn程序，將人與6物種(猴、犬、牛、豬、小鼠和大鼠)的CYP2E1氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖7所示.人類與猴相似度為96%;與大鼠、小鼠相似度均為80%，與牛相似度為71.2%，與犬相似度為72%，與豬相似度為70%.說(shuō)明CYP2E1蛋白在進(jìn)化上具有高度保守性.

圖7 人與6物種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic trees of human being and other 6 species

3 結(jié)論

本文通過(guò)對(duì)CYP2E1的一般性質(zhì)、親疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、活性中心、跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽以及亞細(xì)胞定位等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，依分析結(jié)果推測(cè)人CYP2E1處在細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)上，可能是膜結(jié)合蛋白，而且是一種跨膜蛋白，即一部分親水肽段在膜外，一部分疏水肽段埋在磷脂雙分子中與膜共價(jià)結(jié)合，催化功能位點(diǎn)則處于親水肽段部位［12］.本文還預(yù)測(cè)了信號(hào)肽剪切位點(diǎn)，表明該基因表達(dá)具有信號(hào)肽，推測(cè)該蛋白在信號(hào)肽的引導(dǎo)下通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進(jìn)入腔內(nèi)進(jìn)行修飾成熟，然后整合在質(zhì)膜上.對(duì)CYP2E1酶活性中心分析表明酶活性中心體積較小，僅為0.19 nm3，這可能與代謝小分子化合物有關(guān);CYP2E1與底物結(jié)合形成類似三明治式結(jié)構(gòu)，如:其分子的Phe205和Phe293殘基可與氯唑沙宗的苯并唑環(huán)形成π－π共軛，Asp202殘基與氯唑沙宗羥基、Ser298殘基與氯唑沙宗氯化基團(tuán)均以氫鍵形式結(jié)合.活性中心的這種結(jié)構(gòu)構(gòu)象也揭示了CYP2E1可與多種底物(如丁二烯、苯胺、甲苯、二甲基亞硝胺、乙醇、月桂酸等)結(jié)合的機(jī)理.

通過(guò)對(duì)人CYP2E1氨基酸序列與其他6種哺乳動(dòng)物該蛋白序列的比較和聚類研究，表明CYP2E1具有高度保守性，人與猴的相似度達(dá)95%，與嚙齒動(dòng)物小鼠和大鼠的相似度為80%，說(shuō)明在生物進(jìn)化過(guò)程中，該基因的保守序列變化很小，以至于其表達(dá)產(chǎn)物的生物活性類似，提示我們?cè)陂_展CYP2E1的毒理學(xué)及藥理學(xué)方面的研究時(shí)，可以考慮以其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(如小鼠、大鼠等)和其細(xì)胞系作為模型實(shí)驗(yàn)材料，深入探討其作用特點(diǎn)與機(jī)理.

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