太子參多糖減輕高脂誘導(dǎo)的小鼠肝臟胰島素抵抗*

王 琪， 柴單單， 吳曉華， 任麗偉， 劉永年△， 于志文△

(1青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研組，青海 西寧 810000； 2福建省閩東力捷迅藥業(yè)有限公司研發(fā)部，福建 寧德 352000; 3福建中醫(yī)藥大學(xué)生物醫(yī)藥研發(fā)中心，福建 福州 350000)

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太子參多糖減輕高脂誘導(dǎo)的小鼠肝臟胰島素抵抗*

王 琪1， 柴單單2， 吳曉華2， 任麗偉3， 劉永年1△， 于志文3△

(1青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研組，青海 西寧 810000；2福建省閩東力捷迅藥業(yè)有限公司研發(fā)部，福建 寧德 352000;3福建中醫(yī)藥大學(xué)生物醫(yī)藥研發(fā)中心，福建 福州 350000)

目的： 通過研究太子參多糖(Radix Pseudostellariae polysaccharide, RPP)減輕高脂肪誘導(dǎo)肝臟胰島素抵抗的作用，探尋其主要影響因素及發(fā)生的分子機(jī)制。方法: 隨機(jī)將C57BL/6J小鼠分為低脂飼料對照組(LFD組)和高脂飼料組(HFD組)，16周后，經(jīng)腹腔注射丙酮酸耐量試驗(IPPTT)確定胰島素抵抗糖代謝紊亂模型成功后，開始進(jìn)行含RPP(500 mg/kg)的高脂飼料干預(yù)(HFD+RPP組)，連續(xù)干預(yù)4周之后，檢測丙酮酸耐量以及肝臟組織和線粒體丙二醛(MDA)含量。同時采用Western blot法檢測肝臟組織中p-AKT(Ser473/Thr308)、p-AMPK、核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)、NQO1 和IκBα的蛋白水平變化。結(jié)果: 經(jīng)RPP干預(yù)后，模型組小鼠血糖水平明顯降低；肝臟和線粒體的MDA水平顯著降低；肝臟組織p-AKT及p-AMPK的蛋白水平明顯增高；NQO1、HO-1和IκBα蛋白水平也同時上調(diào)。結(jié)論: 太子參多糖能夠有效抑制高脂肪誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠高血糖作用，其機(jī)制可能與改善肝臟胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，同時激活Nrf2信號通路及抑制肝臟炎癥信號激活作用有關(guān)。

C57BL/6J 小鼠； 胰島素抵抗； 太子參多糖； 氧化應(yīng)激； 丙二醛

胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是2型糖尿病發(fā)病的重要機(jī)理[1]，而物質(zhì)代謝紊亂誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是IR發(fā)生的關(guān)鍵誘因[2]。同時，糖代謝受胰島素信號及AMPK的抑制性調(diào)控[3]。而炎癥因素也可以損害胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)而干擾其對血糖代謝的調(diào)節(jié)[2, 4]。近年來,中藥多糖如黨參多糖、枸杞多糖等降血糖以及改善IR的作用日益受到臨床重視[5-7]。多項研究表明，中藥多糖能通過清除氧化自由基起到增加胰島素敏感性的作用[8-9]。太子參為常用補(bǔ)益中藥，治療氣陰兩虛、燥熱傷津型糖尿病[10]。太子參多糖(Radix Pseudostellariae polysaccharide，RPP)是從中藥太子參塊根中提取相關(guān)的主要生物活性物質(zhì)，具有降血糖、降血脂等藥理學(xué)作用[11]。目前，雖然RPP減輕IR與抗炎、對抗氧化應(yīng)激已有報道，但相關(guān)作用機(jī)理并不清楚[12]。我們前期的工作表明，高脂肪可以損害體內(nèi)重要的抗氧化系統(tǒng)核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)功能，而激活這一系統(tǒng)不僅可以緩解小鼠組織的氧化應(yīng)激而且增強(qiáng)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[13]。由于氧化應(yīng)激在糖代謝紊亂中的重要作用，本研究通過高脂飼養(yǎng)誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠為IR模型，以胰島素信號及體內(nèi)重要的抗氧化調(diào)控系統(tǒng)——Nrf2信號通路為研究靶點(diǎn)，探討太子參多糖對改善高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗作用及其可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 動物與飼料 SPF雄性6周齡C57BL/6J小鼠30只，動物許可證為SYXK(粵)2013-2002，體重(20.0±0.7)g, 購自廣東醫(yī)學(xué)實(shí)驗動物中心；小鼠分組后，分別喂食低脂及高脂飼料。

1.2 藥品與試劑 太子參多糖由福建省閩東力捷迅藥業(yè)有限公司提供；血糖試紙均購自魚躍生物醫(yī)藥有限公司；丙二醛測定試劑盒、ECL顯影試劑和BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；Nrf2、NQO1和HO-1抗體購自CST；p-AKT和p-AMPK抗體購自Santa Cruz；其它藥品和試劑均購于上海銘?？萍加邢薰竞蚐igma。

1.3 儀器 AU600型全自動生化分析儀(Beckman)，752型紫外分光光度計(上海光學(xué)儀器廠)， DYCZ-25D型電泳儀、Mini TBC 濕轉(zhuǎn)儀和GelDoc XR System凝膠成像分析系統(tǒng)Bio-Rad。

2 方法

2.1 動物模型的建立與分組 C57BL/6J小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，分別低脂、高脂飼料喂養(yǎng)4個月。進(jìn)行腹腔注射丙酮酸耐量試驗(intraperitoneal pyruvate tolerance test，IPPTT)測定后，確認(rèn)高脂誘導(dǎo)胰島素抵抗小鼠模型成功后，設(shè)置高脂飲食(high-fat diet, HFD)組、太子參多糖(HFD+RPP)治療組和低脂飼養(yǎng)(low-fat diet, LFD)組。治療組灌胃給藥4周，HFD組和LFD組給予等量的生理鹽水。

2.2 IR模型的建立及太子參多糖調(diào)節(jié)高脂飲食的作用 太子參多糖500 mg·kg-1·d-1灌胃給藥處理4周后，所有小鼠禁食16 h不禁水，進(jìn)行IPPTT，腹腔注射丙酮酸(2 mg/kg)，分別從尾靜脈取血，記錄空腹及注射后15 min、30 min、60 min、120 min血糖值。用梯形法計算曲線下面積(area under the curve，AUC)，以更靈敏地反映了IPPTT各時點(diǎn)血糖值總和及在整體時段的變化趨勢。

2.3 標(biāo)本的采集及處理 太子參多糖干預(yù)4周后，小鼠禁食不禁水過夜。處死前腹腔注射胰島素0.6 U/kg，15 min后斷頭取血，靜置后4 ℃離心；同時立即取肝臟組織，快速放入液氮中，-80 ℃冰箱保存。

2.4 肝臟線粒體提取 采用差速離心法提取肝臟線粒體[14]，并用BCA法多功能酶標(biāo)儀定量蛋白濃度。

2.5 丙二醛(malondialdehyde，MDA)的測定 采用硫代巴比妥酸方法，具體操作按照廠家的說明書進(jìn)行，用紫外分光光度法檢測MDA，并于562 nm波長處測量A值。

2.6 Western blot 肝臟組織或HepG2細(xì)胞加入裂解液進(jìn)行勻漿，提取總蛋白，SDS-PAGE分離蛋白后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，封閉后 I 抗4 ℃孵育過夜，TBST振蕩洗滌3次后，II 抗37 ℃孵育1 h，TBST振蕩洗滌4次后，ECL發(fā)光顯色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 太子參多糖減輕丙酮酸誘導(dǎo)的糖異生作用

為研究RPP對血糖代謝調(diào)節(jié)作用，我們進(jìn)行了以丙酮酸為肝糖異生原料的耐量實(shí)驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高脂飼養(yǎng)組小鼠在丙酮酸注射后，各時點(diǎn)血糖水平較低脂組明顯升高，而太子參多糖干預(yù)后，空腹及60 min、120 min血糖較HFD組均明顯降低(P<0.05)。RPP干預(yù)后120 min 時間曲線的 AUC面積減少(P<0.01)。同時RPP減輕了高脂誘導(dǎo)的肝臟重量的增加(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The results of intraperitoneal pyruvate tolerance test (IPPTT), AUC and liver weight in each group. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vsLFD group;#P<0.05,##P<0.01vsHFD group.

圖1 RPP干預(yù)后IPPTT改善，AUC下降，肝臟重量減輕

2 太子參多糖增強(qiáng)胰島素信號及改善AMPK胰島素增敏信號的傳導(dǎo)作用

胰島素信號對于肝糖代謝起重要的調(diào)節(jié)作用。為進(jìn)一步探討RPP減輕肝臟糖代謝損害作用機(jī)理，我們用Western blot方法檢查了肝組織的胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。對于胰島素信號蛋白AKT磷酸化檢測表明，高脂飼養(yǎng)組小鼠肝臟AKT磷酸化明顯減少，而RPP則可增強(qiáng)胰島素刺激的AKT磷酸化。另外，RPP干預(yù)明顯增強(qiáng)了AMPK蛋白的磷酸化水平，見圖2。

3 太子參多糖抗氧化作用及激活Nrf2抗氧化系統(tǒng)作用

氧化應(yīng)激可以損害胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而MDA是脂質(zhì)過氧化指標(biāo)。為了研究是否通過抗氧化起到緩解IR作用，我們測定了肝臟組織及線粒體的MDA水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),高脂飼養(yǎng)組小鼠肝臟MDA水平升高，這一作用在線粒體更為顯著。而RPP干預(yù)則可明顯降低肝臟組織及線粒體的MDA水平。由于Nrf2是體內(nèi)重要的抗氧化系統(tǒng)，調(diào)控NQO1及HO-1等抗氧化酶表達(dá)，我們檢查了RPP是否通過激活Nrf2系統(tǒng)起到抗氧化作用。研究結(jié)果表現(xiàn)為RPP 顯著改善了高脂誘導(dǎo)降低Nrf2及NQO1蛋白表達(dá)降低的過程，見圖3。

Figure 2.The liver protein levels of p-AKT (Ser473/Thr308) and p-AMPK detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsLFD group;##P<0.01vsHFD group.

圖2 Western blot檢測RPP干預(yù)后肝臟組織AKT和AMPK的磷酸化水平

4 太子參多糖干預(yù)抑制肝臟炎癥信號作用

IκBα是炎癥激活的抑制性蛋白，其含量降低提示炎癥激活。對于這一蛋白的Western blot實(shí)驗結(jié)果表明，RPP抑制了高脂肪飼養(yǎng)小鼠肝臟IκBα蛋白的降解，增加了IκBα的表達(dá)，見圖4。

討 論

多糖是所有生命有機(jī)體的重要組成部分，存在于一切細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中，參與多種生命功能活動。其具有降血壓、降血脂、降血糖、增強(qiáng)免疫、抗疲勞、抗衰老、增強(qiáng)骨髓造血機(jī)能、抗輻射等藥理作用。太子參在糖尿病治療方面具有悠久的歷史，是治療糖尿病常用的中藥之一，多糖是其主要活性成分，具有降低血糖、血脂等多種藥理學(xué)作用[11]。但目前為止，對于其改善糖代謝作用的分子信號機(jī)制并無深入研究。本研究通過給C57BL/6J小鼠喂食高脂飲食16周，建立高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗模型[13]。

Figure 3.MDA concentrations and Nrf2 and NQO1 protein expression in the liver tissues. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsLFD group;#P<0.05,##P<0.01vsHFD group.

圖3 RPP干預(yù)后肝臟和線粒體MDA下降，Nrf2和NQO-1蛋白表達(dá)升高

Figure 4.The protein expression of IκBα in the liver tissues in each group determined by Western blot.*P<0.05vsLFD group;##P<0.01vsHFD group.

圖4 RPP干預(yù)后肝臟IκBα蛋白表達(dá)升高

給予太子參干預(yù)治療后，Western blot實(shí)驗檢測顯示，肝臟胰島素抵抗信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)明顯改善，因而起到改善糖耐量的作用。Houstis等[15]曾提出氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)胰島素抵抗重要機(jī)理?；钚匝醮?reactive oxygen species，ROS)過量產(chǎn)生，抗氧化酶表達(dá)不足，造成氧化/抗氧化系統(tǒng)平衡失調(diào)，ROS不能被及時清除而大量蓄積，從而引起氧化應(yīng)激反應(yīng)[15]。眾所周知，MDA脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志產(chǎn)物，能間接反映機(jī)體氧化應(yīng)激水平。本研究發(fā)現(xiàn)，高脂誘導(dǎo)的肥胖IR鼠肝臟MDA水平明顯增高，尤其線粒體中氧化應(yīng)激水平尤為顯著。這一發(fā)現(xiàn)為太子參多糖改善胰島素抵抗和增強(qiáng)胰島素信號提供了明確的線索。Nrf2是機(jī)體氧化應(yīng)激的感受器，在細(xì)胞抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。Yu等[13]發(fā)現(xiàn)，高脂可誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生過多ROS，超過機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的代償后，可以導(dǎo)致Nrf2系統(tǒng)損害。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，活化的Nrf2與胞核內(nèi)的抗氧化反應(yīng)元件(anti-oxidative response elements， ARE)的特異識別位點(diǎn)相結(jié)合，上調(diào)下游靶分子NQO1、HO-1、SOD等抗氧化酶的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)[16-17]。本研究證實(shí)，高脂誘導(dǎo)Nrf2蛋白表達(dá)明顯降低并伴有靶分子NOQ1表達(dá)下調(diào)，同時發(fā)現(xiàn)經(jīng)太子參多糖治療后Nrf2蛋白表達(dá)明顯增多并伴有靶分子表達(dá)上調(diào)。

另外大量實(shí)驗表明，炎癥在胰島素抵抗和2型糖尿病的形成和發(fā)展過程中有重要作用，而氧化應(yīng)激與炎癥激活之間有著密切的內(nèi)在聯(lián)系[18-19]。Hu等[12]研究發(fā)現(xiàn)太子參多糖能夠減輕糖尿病大鼠的炎癥因子水平。本工作更進(jìn)一步證實(shí)了RPP可以明顯抑制高脂肪誘導(dǎo)IR小鼠肝組織的炎癥信號。因此RPP對抗氧化應(yīng)激作用及抑制由此激發(fā)的炎癥反應(yīng)可能是其改善胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的潛在機(jī)理。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)太子參多糖可以通過改善胰島素信號通路，激活A(yù)KT、AMPK、Nrf2/NQO1信號通路、從而抑制胰島素抵抗，起到改善糖代謝紊亂的作用。 因此，太子參多糖的這種保護(hù)作用與其抗氧化應(yīng)激和抗炎癥激活，從而改善胰島素信號的作用有關(guān)。

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Radix Pseudostellariae polysaccharide attenuates high fat diet induced hepatic insulin resistance in mice

WANG Qi1, CHAI Dan-dan2, WU Xiao-hua2, REN Li-we3, LIU Yong-nian1, YU Zhi-wen3

(1DepartmentofPathophysiology,MedicalCollegeofQinghaiUniversity,Xining810000,China;2DepartmentofResearchandDevelopment,FujianMindongRejuvenationPharmaceuticalCo.,Ltd,Ningde352000,China;3BiologicalMedicineResearchandDevelopmentCenter,FujianTraditionalChineseMedicineUniversity,Fuzhou350000,China.E-mail:liuyongnian@qhu.edu.cn;yuzhiwen@yahoo.com)

AIM: To study the role of Radix Pseudostellariae polysaccharide (RPP) in hepatic insulin resistance. METHODS: Six-week-old C57BL/6J mice were randomly divided into low-fat diet (LFD) control group and high-fat diet (HFD) model group. After 16 weeks, intraperitoneal pyruvate tolerance test (IPPTT) was performed to determine the establishment of the HFD-induced hepatic insulin resistance model. HFD containing RPP (500 mg/kg) was given for 4 consecutive weeks. IPPTT, liver malondialdehyde (MDA) level and liver mitochondrial MDA level were measured. The protein levels of p-AKT (Ser473/Thr308), p-AMPK， nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2), NQO1 and IκBα in the liver tissues were measured by Western blot. RESULTS: After administration of RPP, a significant reduction in the levels of blood glucose and hepatic mitochondrial MDA was observed. The levels of p-AKT (Ser473/Thr308) and p-AMPK were significantly elevated in the liver tissues. The hepatic IκBα levels were up-regulated. RPP also enhanced the expression of Nrf2 system-regulated proteins NQO1 and HO-1 in the liver tissues. CONCLUSION: Radix Pseudostellariae polysaccharides effectively reduce HFD-induced hepatic insulin resistance in C57BL/6J mice and improves liver glucose metabolism by ameliorating HFD-impaired hepatic transduction of insulin signaling, activating Nrf2-associated signaling and inhibiting the expression of inflammatory signaling proteins.

C57BL/6J mice; Insulin resistance; Radix Pseudostellariae polysaccharide; Oxidative stress; Malondialdehyde

1000- 4718(2015)04- 0685- 05

2014- 11- 29

2015- 03- 03

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81270886)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.020

△通訊作者 Tel: 0971-6153781； E-mail: liuyongnian@qhu.edu.cn; yuzhiwen@yahoo.com